撰文丨李杰，勤浩医药首席科学官
编译丨不器
编辑丨于靖
如果要阻挡扬子江的水流，在上游建坝更有效，还是在下游建坝更有效？这个问题没有实际意义。在任何地方筑坝都会使水流停止，无论时间多么短暂。
那么生化级联呢？阻挡上游目标更有效，还是阻挡下游目标更有效？这正是我们在研究细胞外信号调节激酶-1/2（ERK-1/2）抑制剂时遇到的问题。
01 上游还是下游？这是一个问题
在众多人类癌症中，Ras/Raf/MEK/ERK（丝裂原活化蛋白激酶，MAPK）信号转导通路被广泛激活。而药物发现方面，MAPK级联可谓硕果累累。在该通路的上游，目前已有两种不可逆的共价KRASG12C抑制剂获得FDA批准：安进的sotorasib（Lumakras）和Mirati的adagrasib（Krazati）。
同时，自2011年Plexxikon的vemurafenib（Zelboraf）出现以来，B-Raf抑制剂也在激增。GSK的达拉非尼（Tafinlar，2013年）和Array BioPharma的安戈非尼（Braftovi，2018年）也加入了B-Raf抑制剂的行列。
MEK紧邻ERK的上游。MEK抑制剂包括GSK的曲美替尼（Mekinist，2013年）、Exelixis的cobimetinib（Cotellic，2015年），以及Array BioPharma的binimetinib（Mektovi，2018年）。实际上，这些MEK抑制剂在所有激酶抑制剂中是相当独特的。它们不仅是异构抑制剂，现在还被发现具有分子胶的功能。
与KRAS/B-Raf和MEK抑制剂相比，ERK1/2小分子抑制剂的开发相对滞后，迄今为止尚未有ERK1/2获批上市。
但阻断ERK1/2酶的理由再充分不过了。一旦被激活，ERK1/2会使50多种下游底物的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，并激活细胞膜和核蛋白，从而促进细胞生长和增殖。事实上，pERK水平是衡量所有激酶抑制剂药效的一个指标。
鉴于ERK1/2在细胞基本过程（包括细胞增殖、生长和存活）中的重要性，ERK1/2在肿瘤适应症方面受到了密切关注，并产生了多个临床候选药物。
02 可逆性ERK1/2抑制剂
2009年，Vertex披露了一系列新型嘧啶吡咯ERK抑制剂。其中，VEX-11e（1）是ERK2的强效粘合剂，口服生物利用度高[1]。它的右侧部分已成为一种持久的药源性，在随后的许多可逆性ERK1/2抑制剂中都能见到。
当然，Astex的ASTX029（2）也含有类似的药理作用。它能调节ERK1/2的磷酸化和催化活性，目前正在晚期实体恶性肿瘤患者中进行I/II期临床试验[2]。
从Astex的经验中，我们可以学到药物设计方面的重要一课。
作为基于片段的药物设计（FBDD）的先驱，Astex通过X射线晶体学和生物物理片段筛选，并在结构指导下进行优化，成功地将苯唑内酰胺3确定为一种强效的ERK1/2抑制剂，并从铰链生长到口袋[3]。
苯唑内酰胺3是一种高效的ERK1/2抑制剂，具有优异的激酶组选择性，但其半衰期短，不到5分钟。它主要的缺点是右侧的甲苯基团和左侧的氧杂环（四氢吡喃，THP）。神奇的是，用1-氟-3-甲氧基苯基取代苯唑内酰胺3上的甲苯基，得到了在CYP3A4中半衰期更长（35分钟）、总体药代动力学特征和口服生物利用度良好的ASTX029（2）[2]。
有趣的是，固定苯唑内酰胺3左侧的软肋似乎同时也将其左侧氧杂环的代谢降至最低。
吉利德发现的ravoxertinib（GDC-0994，4），也为药物代谢最小化提供了可资借鉴的经验[4]。
吉利德与Array BioPharma合作，发现了一系列新型ATP竞争性ERK1/2抑制剂，哌啶嘧啶脲5就是其中的代表。
尽管脲5具有强效和良好的体外ADME特性，但在多个物种（包括小鼠、大鼠、小猎犬和金丝猴）中，存在清除率高和口服生物利用度低的问题。科学家通过“骨架跃迁”（Scaffold-hopping）发现了吡啶酮6，它是一种强效、选择性和高效的ERK1/2抑制剂[5]。
遗憾的是，尽管吡啶酮6具有许多理想的属性，但根据小鼠异种移植数据的PK/PD建模和异计量比例推算出的人体剂量，被认为过高（> 1克/天）而令人无法接受。
将吡啶酮6在小鼠、狗、大鼠和金丝猴肝细胞中孵育3小时后，鉴定出羟基酸7为主要代谢产物。用杂芳族取代软THP分子的努力，最终导致N-甲基吡唑成为最佳选择。由此产生的ravoxertinib（4）显示出优异的临床前PK/PD和药效特征。加上耐受性研究中相对安全的特征，ravoxertinib（4）被转入临床试验[4]。目前，该药正处于I期临床试验阶段，可单独或与MEK抑制剂cobimetinib联合用药。
在ERK1/2抑制剂中，N-甲基吡唑取代基显然对CYP3A4代谢具有抗性。它还出现在阿斯利康的AZD0364（ATG-017, 8）中，这是一种强效、选择性的ERK1/2口服抑制剂[6]。
此外，BioMed Valley和Vertex于2017年披露了其ERK1/2抑制剂候选药物ulixertinib（BVD-523，9）[7]。据今年的报道，Ulixertinib（9）是首个同类ERK抑制剂，在MAPK驱动的临床前小儿低级别胶质瘤模型中显示出良好的活性[8]。
其他几种ERK1/2抑制剂，目前也在临床试验中。礼来的LY3214996（10，II期）[9]和诺华的LTT462（11，Ib/IIa期）[10]，就是另外两个例子。
2022年，业内发表了一篇关于ERK1/2抑制剂的综述[11]。
03 不可逆共价ERK1/2抑制剂
靶向共价抑制剂正备受关注，成为流行。
Celgene/BMS的不可逆共价ERK1/2抑制剂CC-90003（12）在复发或难治性BRAF或RAS突变肿瘤患者中进行了Ia期临床试验[12]。
Astex于2015年披露了他们的不可逆共价ERK1/2抑制剂13。共价抑制剂13从高通量筛选的苗头（hit）开始，被发现作为一种选择性共价工具化合物，用于潜在的体外和体内研究，以评估靶向ERK1/2的风险、益处[13]。
2022年，Astex利用高通量蛋白质晶体学作为主要的靶点发现技术，设计和表征了一个以丙烯酰胺为重点的亲电片段库，并针对ERK2进行了筛选。该团队确定了一种共价ATP竞争性抑制剂14，它与ATP催化口袋中的Cys166残基共价结合[14]。
04 异构ERK1/2抑制剂
异构抑制剂相对于正构抑制剂的优势是众所周知的。
早在2015年，Herrero等就报道了一种小分子抑制剂DEL-22379（15），它可以抑制ERK1/2二聚化，IC50为500 nM。它不改变ERK磷酸化，因此对ERK激酶活性没有影响。DEL-22379（15）的结合位点被确定在ERK2二聚化界面的沟槽中。据推测，15通过对接二聚化界面抑制ERK二聚化，从而阻止两个ERK分子之间的相互作用[15]。
2019年，Sammons及其同事公开了一系列化合物，这些化合物能与ERK2的D-招募位点（DRS）结合，从而抑制ERK2磷酸化DRS靶向底物。此外，该化合物能以剂量依赖的方式阻断组成型活性MEK1突变体对ERK2的激活，IC50为9.9 μM。遗憾的是，这些化合物并不像药物，只能作为很好的工具化合物[16]。
05 总结
从我们开始研究ERK1/2到现在已经过去了二十多年。尽管已有十几种ERK1/2抑制剂进入临床试验，但迄今为止还没有一种获得FDA批准。
其中，Vertex的ulixertinib（9）在MAPK驱动的临床前小儿低级别胶质瘤模型中，显示出了良好的活性。
谁能首先发现ERK1/2抑制剂在更多患者中的疗效，谁就将成为ERK领域的最大赢家。
参考文献：
1.Aronov, A. M.; et al. Structure-guided design of potent and selective pyrimidylpyrrole inhibitors of extracellular signal-regulated kinase (ERK) using conformational control. J. Med. Chem. 2009, 52, 6362–6368.
2.Murray, C. W.; Berdini, V.; Bevan, L.; Buck, I. M.; Carr, M. G.; Courtin, A.; Coyle, J. E.; Day, J. E. H.; East, C.; Fazal, L.; et al. Discovery of ASTX029, A Clinical Candidate Which Modulates the Phosphorylation and Catalytic Activity of ERK1/2. J. Med. Chem. 2021, 64, 12286–12303.
3.Heightman, T. D.; Berdini, V.; Braithwaite, H.; Buck, I. M.; Cassidy, M.; Castro, J.; Courtin, A.; Day, J. E. H.; East, C.; Fazal, L.; et al. Fragment-based discovery of a potent, orally bioavailable inhibitor that modulates the phosphorylation and catalytic activity of ERK1/2. J. Med. Chem. 2018, 61, 4978‒4992.
4.Blake, J. F.; Burkard, M.; Chan, J.; Chen, H.; Chou, K.-J.; Diaz, D.; Dudley, D. A.; Gaudino. J. J.; Gould, S. E.; Grina, J.; et al. Discovery of (S)-1-(1-(4-Chloro-3-fluorophenyl)-2-hydroxyethyl)-4-(2-((1-methyl-1H-pyrazol-5-yl)amino)pyrimidin-4-yl)pyridin-2(1H)-one (GDC-0994), an Extracellular Signal-Regulated Kinase 1/2 (ERK1/2) Inhibitor in Early Clinical Development. J. Med. Chem. 2016, 59, 5650‒5660.
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