生物世界 / nagashi
蛋白质是生命活动的主要承担者。然而，当蛋白质发生错误折叠或过度积累时，可能导致严重的后果。例如阿尔茨海默病，其关键性病理标志是神经元胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块和胞内神经元纤维tau缠结的聚集。因此，如果能实现程序控制致病蛋白的体内靶向降解，将成为阿尔茨海默病、癌症等众多蛋白质异常疾病治疗领域的新革命。
2024年3月15日，麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的刘如谦（David Liu）团队在 Science 期刊发表题为：Continuous evolution of compact protein degradation tags regulated by selective molecular glues 的研究论文。
该研究基于噬菌体辅助连续进化（PACE）平台开发了一种新型靶向蛋白质降解系统。利用PACE技术进化出了一种紧凑型降解子（degron）——SD40，其可通过先导编辑（Prime editing）技术精确插入人类细胞基因组中，可与分子胶结合并招募E3泛素连接酶效应物（例如CRBN）对细胞内靶标蛋白进行快速降解，且不会对其他蛋白造成干扰。
新型锌指结构域指导其标记的内源性蛋白的特异性降解
近年来，以PROTAC为代表的靶向蛋白质降解（TPD）技术成为了研究热门，并被认为是最有可能解决难成药靶点的突破性技术之一。这种新兴技术就像是在细胞内装上一个精准的“导弹系统”，能够直接靶向清除那些引起疾病的致病蛋白。
其中，基于小分子触发的蛋白质降解标签（degron，也称为降解子），例如PROTAC，成为TPD技术的代表。当细胞中存在特定的小分子（分子胶）时，degron与E3泛素连接酶效应物（例如CRBN）形成三元复合物——degron-小分子-E3连接酶，该复合物随后被泛素-蛋白酶体系统识别并降解。
然而，大多数已知的degron标签通常是分子量较大的蛋白质结构域，难以将其融合到内源性蛋白的编码基因中。虽然锌指结构域理论上足够小，可以很方便地进行内源性标记，但其降解是由沙利度胺（Thalidomide）、泊马度胺（Pomalidomide）和来那度胺（Lenalidomide）等免疫调节药物（IMiD）来触发的，具有显著的脱靶降解作用，因此无法作为目标蛋白水平的特异性调节剂使用。
这项最新研究建立在前不久发表于 Nature Chemistry 期刊的一项研究的基础上【2】，共同通讯作者 Amit Choudhary 等发现了许多沙利度胺衍生物，沙利度胺是一种经典的分子胶，与CRBN相互作用，引发蛋白质降解，可用于治疗某些癌症和皮肤病。尽管沙利度胺会破坏许多蛋白质，但一种名为PT-179的衍生物相对惰性，这使得它成为更精确的分子胶系统的一个很好的起点。
在这项最新 Science 论文中，研究团队使用了一种名为噬菌体辅助连续进化（PACE）的系统，该系统于2011年由刘如谦实验室首次开发，可以模拟生物进化过程，产生具有指定功能的生物分子。PACE系统可以使定向进化的速度比传统方法快100倍，允许研究人员快速进化出具有理想功能的新蛋白质。
刘如谦团队聚焦于锌指结构域，这是一种已知与分子胶结合的CRBN相关蛋白质基序。通过PACE系统进行数百代的迭代进化，研究团队获得了一种全新的锌指结构域，其肽链短至36个氨基酸，称为SD40。SD40可以与PT-179、CRBN形成三元复合物，启动融合靶蛋白的降解，无论它位于靶蛋白的N端还是C端。
通过PACE系统获得新型锌指degron标签——SD40
紧接着，研究团队使用先导编辑（Prime editing）将SD40插入到人类细胞的基因组中，并标记两种不同的蛋白质。先导编辑技术是刘如谦实验室于2019年开发的新一代精准基因编辑系统，其最大的优势在于可以实现多样化编辑，无需DNA双链断裂（DSB）即可精准编辑基因组。由于SD40足够小，可以很方便、高效、精确地插入到人类细胞基因组的靶蛋白编码基因中，从而能够对维持其天然调控环境的基因产生的内源性蛋白质进行最小扰动的研究。
研究团队观察到，在加入PT-179几分钟后，SD40标记的靶蛋白开始从人类细胞中消失，最终被彻底清除。更重要的是，研究团队对数千种的非靶蛋白进行了评估，没有观察到任何影响，证实了SD40的靶标特异性。
在加入PT-179几分钟后，SD40标记的靶蛋白开始从人类细胞中消失，最终被彻底清除
为了深入了解SD40、PT-179和CRBN是如何相互作用的，研究团队通过冷冻电镜对该三元复合物进行了三维结构分析。他们发现，当CRBN与SD40、PT-179结合时，CRBN呈封闭构象，SD40与CRBN的C端结构域相互作用，同时也与CRBN的N端结构域形成广泛的界面。这项工作表明，CRBN可能需要形成封闭构象，以便将信息传递给复合体中的其他蛋白质，进而标记目标蛋白质进行靶向清除。
SD40、PT-179和CRBN结合的三元复合物的低温电子显微镜结构
此外，由于人类细胞和小鼠细胞中降解蛋白质的细胞机制不同，研究团队还进化出一种与小鼠细胞中发现的CRBN结合的锌指degron——SD56，PT-179在培养的小鼠细胞中可以有效降解SD56标记的蛋白质，并且SD56可以对经典IMiD和下一代IMiD产生反应。SD56在涉及人类疾病的转基因小鼠模型的研究中可能很有用。
总的来说，该研究通过噬菌体辅助连续进化（PACE）技术进化出可以实现靶向降解的degron，通过添加PT-179即可在几分钟内清除靶标蛋白，并且不会对其他非靶标蛋白造成影响，保留天然基因组表达谱，从而最大限度地减少对许多蛋白质天然生物学功能至关重要的调节机制的干扰。据悉，刘如谦团队正在与癌症生物学和其他领域的科学家合作，利用进化得来的degron来标记和降解有潜在治疗价值的蛋白质。
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