随着基因工程的不断发展, 对重组性治疗蛋白的需求大幅度增长。治疗性单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)作为一种重要的重组蛋白具有特异性和免疫原性小等特点, 近年来发展迅速,己成为肿瘤、免疫系统疾病等多种疾病的前沿治疗药物。近几年，平均每年有15 种以上重组蛋白新药通过美国食品和药物管理局(FDA)批准，并且在几个重磅生物抗体药专利即将到期促使生物仿制药出现的刺激下，全球生物抗体药销售额已超过1800亿美元每年。
在抗体药物生产中，上游构建表达过程尤为重要，关系到整个抗体药物的质量及药效，我们从单克隆抗体药物工业生产中宿主细胞选择、表达载体构建、转染方法、筛选技术、细胞培养工艺技术方法以及最后选定细胞株的标准等，结合单抗药物CHO细胞株开发和培养工艺的经验，对当前我国单抗CHO 细胞株开发技术策略进行了探讨。
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宿主细胞
哺乳动物细胞是临床抗体药物产品使用的主要表达系统。对于治疗性抗体而言，为了满足其生物活性，需要进行正确的折叠和翻译后修饰，因此用于生产治疗性抗体的宿主细胞往往是哺乳动物细胞，主要包括：Sp2/0 骨髓瘤细胞、NS0 小鼠骨髓瘤细胞、HEK293人胚胎肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO），其中以 CHO 细胞用途最为广泛。
与其他表达系统相比, CHO表达系统占有很大优势:(1)更适用于悬浮培养,可以满足大规模工业生产重组蛋白的要求；(2)产生的抗体分子在结构、功能方面和天然抗体分子较接近；(3)所含人类病毒极少；(4)外源基因可以在CHO细胞中稳定地整合；(5)CHO细胞是成纤维细胞, 几乎不分泌内源性蛋白, 因此对目标重组抗体的分离纯化工作十分有利。
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表达载体的构建与转染
生产用稳定细胞株的构建首先由表达载体的构建和细胞转染开始，将表达抗体的目的基因构建到载体上，再将该载体转染进入宿主细胞内。常见的转染方式主要有磷酸钙转染、电穿孔转染、脂质体转染和逆转录病毒转染。DNA进入宿主细胞核后将会随机整合到宿主细胞基因组中，因此其表达水平与基因拷贝数、基因整合位点的转录活性有关。然后，不同筛选试剂将被用于筛选能够正确表达目的基因并且高水平表达的细胞池。由于此时得到的细胞池中的每个细胞特性各异，具有不同的基因整合位点、拷贝数、细胞单产和生长速率，因此需要将其中具有高产、稳定表达特性的细胞个体分离出来分别培养，通常需要获得数百甚至上千的候选克隆供进一步筛选。被筛选出来的克隆经过传代培养和分批补料（fed-batch）实验，比较其生长特性、代谢状况、表达量高低、表达产物质量等因素，选出最优的几个克隆进入生物反应器放大实验，最终确定生产用单克隆细胞株。如下图。
适合于CHO细胞表达的载体(Vector)的基本元素包括: 启动子(promoter)、poly A加尾信号(poly A signal)、筛选标记( selectable marker)、克隆位点(cloning site)和复制起始位点(origin of replication)，有些还有报告基因( reporter gene)。启动子一般较多采用SV40和CMV两种，CMV启动子通常位于目的基因(轻链和重链可变区基因)之前，而SV40则位于筛选标记之前。筛选标记一般有两种：代谢型和抗生素型，或者也可称为扩增型基因筛选标记和非扩增型基因筛选标记。常见的筛选标记见下表，当前工业界较多采用的筛选标记为DHFR、GS、G418和puromycin等。
哺乳动物细胞表达载体中常用的筛选标记
目前，商业中所选择的载体供应商主要是Life technologies 公司，从pcDNA3系列到Freedom pCHO1.0,其大小由原来的4000～5000bp到现在的近13000bp不等。pcDNA3.1是Life technologies公司早期开发的载体,其构造相对较简单。pOptiVEC-TOPO载体的最大特点在于具有TOPO酶和IRES(internal ribosome entry site)组件，TOPO酶具有无缝克隆的特点，与多克隆位点相比，优势在于插入目的基因时不会带有酶切位点,而IRES 组件的功能主要是能够将它所连接的两个基因共用同一个启动子进行表达。
为了得到稳定高产的细胞株，往往使用 MTX 或者氨基亚砜蛋氨酸（methionine sulfoximine，MSX）进行筛选扩增，据相关文献报道，同时使用 MTX 和 MSX 可以显著提高筛选的效果。
MTX是DHFR的特异性抑制剂。当宿主细胞是DHFR-，如CHO-DG44，转染的载体上含有DHFR基因，MTX能够促使细胞增加包含DHFR基因和目标蛋白基因在内的基因拷贝数。通过不断增加MTX的浓度可以逐步增加拷贝数，直到随着MTX浓度的增加，拷贝数不发生明显改变，即拷贝数不再变化。在载体构建的过程中，可以使用较弱的启动子来弱化DHFR基因的表达或者改造DHFR的基因使之不稳定，从而增加 MTX的筛选扩增效果。
MSX是一种跟MTX类似的代谢类抑制剂，它能够特异性抑制谷氨酸合成酶（glutamine synthetase，GS）。对比DHFR筛选系统，GS较少用于单抗的表达生产，其主要原因是有实验表明 GS 系统较为不稳定，即随着细胞培养时间的延长，其表达量出现明显下降。由于实际生产用的稳定细胞株一般要求经过12周的稳定性实验，表达量的下降应小于30%，故DHFR系统在生物制药工业广泛使用。
另一方面，插入染色体的位置也影响着真核基因的表达，即“位置效应”。当外源基因插入异染色质及其附近区域产生位置效应时，此处异染色质区域将产生位置效应斑点，此时，周围的异染色质将有效地阻止插入基因的表达。为了克服“位置效应”，一般有两种办法：将目的基因定点整合到合适的位点，或者在目的基因的侧翼加上“绝缘子”DNA 序列，从而抑制“位置效应”。
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转染方法
转染类型一般有稳定转染和瞬时转染两种。在单抗细胞株筛选稳定转染前通常通过瞬时转染得到一些抗体，进行质量分析，以初步判断抗体是否满足需要，或者进行一些前期的启动子、密码子等组件的优化。稳定转染中外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体存在。在CHO细胞中进行稳定转染时，外源DNA整合到CHO染色体上，未整合的游离态的DNA会随传代而丢失。
常用于哺乳动物细胞转染的方法有磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法和电穿孔法，使用最多的是阳离子脂质体法和电穿孔法。
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高表达细胞株的筛选
筛选高表达单克隆细胞株是细胞株构建的关键步骤，衡量标准包括抗体表达量、产品质量、代谢稳定性、细胞稳定性等。当目的基因被转染到宿主细胞内，并按照一定的细胞密度在合适的筛选压力下进行传代培养后便得到了细胞池。细胞池的表达量取决于转染的方式、筛选压力的作用以及目的基因整合情况。由于目的基因整合具有很大的随机性，即使用相同的方法进行转染和筛选，表达量依然会体现出极大的差异性，接下来就要从细胞池中筛选出高产稳定的细胞株。
CHO细胞转染之后，通常会做一个克隆池(pool)，然后进行筛选。筛选策略主要涉及抗生素或药物的代谢途径，常见的筛选试剂包括puromycin、G418、MTX和MSX等。Puromycin为氨基糖甙类抗生素，通过干扰核糖体功能阻断哺乳动物细胞的蛋白质合成，来自链霉菌的pac基因具有解除嘌呤霉素(puromycin)毒性的作用，在筛选的时候，puromycin浓度一般在10～50ug/ml；G418也是一种氨基糖苷类抗生素，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂之一，G418在筛选的时候一般浓度范围为200～1000ug/ml；MTX为叶酸拮抗剂，在细胞内经过转换后可抑制DHFR的活性，抑制核酸合成，引起细胞毒性。Schimke等的研究显示，随着MTX浓度的增加，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，DHFR基因得以扩增，目的基因拷贝数随之增加，提高了表达量。MTX筛选时，一般浓度范围为25～1000 nmol/L；MSX筛选采用的是谷氨酰胺合成酶基因GS系统压力，谷氨酰胺合成酶(GS)扩增系统是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效应。MSX筛选时，一般浓度范围为25～500 umol/L。
常用的筛选克隆的方法包括：有限稀释法（limiting dilution cloning，LDC）、流式细胞仪分选法（fluorescence activated cell sorter，FACS）、半固体培养基筛选法等。其中有限稀释法因为其低成本和易于操作，曾广泛运用于克隆的筛选。该法是将细胞稀释到极低的细胞密度，并将稀释好的细胞置于96孔板中培养，使孔板中每个孔的理论细胞数小于1个，稀释后使用显微镜对96孔板整板拍照，以确保单克隆。经过一段时间的培养后使用酶联免疫吸附反应选取表达量高的细胞扩大培养。有限稀释法往往需要重复两次，以确保单克隆细胞株的纯度。
另一种开始广泛使用的方法是流式细胞仪分选法。将带有荧光标记的二抗和分泌抗体的CHO细胞混合孵育，分泌到细胞表面的抗体就能够被流式细胞仪检测到，从而利用其分选功能筛选出分泌多的细胞。为了使分泌到胞外的抗体能够维持在细胞膜表面，还可以使用微囊将细胞以及分泌的抗体包裹起来。目前，又有新的方法运用于流式细胞仪分选，即将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的两个基因片段作为报告基因分别构建到抗体重链和轻链的表达载体上进行共转染，当这两个片段都整合到细胞内进行表达时，能够产生绿色荧光蛋白而发出绿色荧光，利用FACS进行分选得到高表达的细胞。使用该方法在转染完成后48h就能够进行检测，可以有效缩短克隆筛选的时间，提高实验效率。
培养细胞的研究首要关心的是存活率与浓度，对于面对细胞培养类型广泛的用户，全自动、高效、高通量的分析系统毫无疑问是替代传统人工方式的首选。贝克曼库尔特的Vi-CELL XR全自动生物图像细胞活力分析系统，令培养细胞的研究工作踏入数码分析时代。Vi-CELL XR以其高效及精确的分析，帮助全球的细胞研究者建立一个标准的细胞实验室平台，为其提供整体的细胞生物信息。在细胞筛选过程中，Vi-CELL XR分析系统每次分析的体积相当于人工方法检测体积的15到30倍，因此Vi-CELL XR的工作量相等于完成了传统工作方式工作量的15次以上，成功地提高了数据统计上的可靠性。细胞图像提供了更详细的描述细胞特性的信息：细胞存活率、数目、浓度、大小、圆度、细胞类型以及细胞直观图像的综合信息，分析报告的客观与专业水平亦明显增强。同时还可以通过分布曲线、细胞图像做出参数调整后再运算，适用于更多细胞类型。
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筛选准则以及检测方法
克隆的筛选通常关注滴度水平及单位时间单个细胞所表达的抗体量( cell specific productivity，Qp) ，选择克隆的Qp在所有克隆中至少要排在中等。工业上所用的克隆Qp一般在20～100pg/cell/d。同时还要关注克隆生长状态，工业上CHO细胞的翻倍时间一般为15～24h,在批次培养或者流加培养的时候，平台期能够尽量长些。筛选的克隆到达摇瓶之后，应尽快建立研究型细胞库( research cell banking，RCB) ，做稳定性试验。考察克隆的稳定性一般会传代至60代，并观察克隆生长的稳定性，即翻倍时间的稳定性；克隆表达的稳定性，即滴度或者Qp 的稳定性；克隆遗传的稳定性；以及克隆质量的稳定性，即克隆前后表达抗体的质量是否有较大差别。克隆进入摇瓶的同时，还会进行cDNA 序列的鉴定、肽图分析、CE-SDS 和SDS-PAGE 单抗纯度分析等，主要为避免抗体氨基酸序列突变或克隆的丢失；进行HPLC-SEC 分析，以剔除容易形成多聚体的克隆；进行糖型分析，尽量避免一些糖型较差的克隆；进行等电聚焦电泳( isoelectric focusing electrophoresis，IEF) 或者成像毛细管等电聚焦电泳(imaged capillary isoelectric focusing，iCIEF) ，以及离子交换色谱HPLC分析，避免一些产生高酸或高碱变体的克隆等。
克隆在摇瓶考察后，需要选定一定数量的克隆进入反应器进行评价，主要考察细胞生长、单抗表达和单抗质量等。一般筛选克隆会做1～2 次亚克隆，以确保是单克隆。当然如果在初期母克隆筛选的时候能够确保是单克隆，可以不做亚克隆。
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细胞培养工艺的优化
细胞株开发的过程中，一般需要在一定的培养工艺平台基础上进行克隆筛选。中试生产申报药品临床试验( investigational new drug，IND) 时，一般会选定2～3个来自不同系列的克隆，其中1～2个克隆作为备选。
培养工艺对最终生物制品的产量、质量和安全有巨大影响，其中以细胞培养基的选择最为重要。在筛选培养基和补料培养基时，初期流加培养时基础培养基和同品牌的补料培养基应该配对进行筛选。初步筛选之后，将基础培养基和补料培养基进行分类，如促进生长类型、维持活率类型、促进表达类型等。将培养基进行混合优化时，尽量将不同类型的培养进行组合，并且应用实验设计( design of experiment，DOE) 优化。
当前，以Amgen、Genentech公司为代表的生物制药巨头所使用的细胞株的蛋白表达量已达到5～10 g/L，Pfizer、MedImmune 公司的个别细胞株甚至超过了10g/L。因此，细胞培养的生物反应器也从过去的大型化（20 kL）向小型化（1kL）、连续性、一次性转变。传统的不锈钢反应器在使用前需要进行彻底的清洁灭菌，而且有着更大的污染的风险，而一次性反应器可以大大节省准备的时间。带有搅拌器的袋式生物反应器，如 Hyclone 公司的 SUB、Sartorius公司的 BIOSTAT 和 Xcellerex 公司的 XDR-DSTB，正越来越多地被运用于治疗性抗体的生产。
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展望
抗体工业蓬勃发展的同时仍存在一些尚未解决的问题，例如抗体分子结构上存在多种翻译后修饰形式、具有显著的“非均一性”、高产细胞株的筛选困难等问题，产生了各种针对高产稳定细胞株筛选的组学研究，并带动了相关基础研究的发展。随着抗体药物相关种类被纳入中国医保目录，在将来的一段时间内，抗体药物在国内将会有更好的市场和发展前景。同时这也对抗体药物生产发展、工艺优化、质量检测等提出了更高的要求。
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