撰文丨Jie Jack Li
2020年12月11日，欧洲药品管理局（EMA）批准了诺华的长效降胆固醇药物inclisiran（商品名Leqvio），这是一款小干扰核糖核酸(siRNA)药物，通过阻断PCSK9（前蛋白转化酶枯草溶菌素9）来降胆固醇。
对比已上市的两种单抗PCSK9抑制剂，Leqvio突出优势在于，两次初始剂量间隔三个月后，只需每六个月注射一次，而已上市的依利库单抗和依洛尤单抗需每两周给药一次。
这是2019年诺华以惊人的97亿美元收购The Medicines Company（TMC）的唯一原因。而inclisiran是TMC于2013年以2.5亿美元从Alnylam手中买入的，这是一笔多么好的投资！
Inclisiran的获批让我们兴奋地看见了高脂血症治疗的新曙光，接下来让我和大家一起回顾高胆固醇血脂治疗的一个个重要节点和里程碑。
胆固醇升高是心血管疾病的主要危险因素
胆固醇对我们的生存至关重要，在大脑中含量最丰富，23%存在于大脑中，占大脑固体物质的1/10。红细胞膜也含大量胆固醇。胆固醇有助于稳定和保护细胞，对产生胆汁酸必不可少，并帮助消化食物中的脂肪。胆固醇还是合成一些激素的原料，包括孕激素、睾酮、雌激素、皮质醇等。
然而，实验数据、遗传和流行病学证据都表明，胆固醇升高是心血管疾病的主要危险因素。胆固醇帮助血管内斑块的形成，斑块收缩或阻塞动脉会导致心绞痛、心脏病发作、中风和许多其他心脏疾病。
1913年，俄国军医尼古拉·阿尼茨科夫通过给兔子喂食纯胆固醇诱发了兔子的动脉硬化。1945年，著名的弗雷明汉心脏研究确定：低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平与心血管疾病的发病率成正比。从上世纪50年代以来，陆续发现了许多降低坏胆固醇的药物。
降血脂药物的发展故事
20世纪50年代，右旋甲状腺素是高胆固醇血症患者的标准治疗方案。不幸的是，过多的甲状腺激素使患者一直发抖。后来，一项大规模长期临床试验确立了右旋甲状腺素与缺血性心脏病的关联。因此，甲状腺激素治疗被终止。
20世纪60年代，雌激素被用来治疗由于LDL-C水平高而导致的心脏病发作。但是一些男性患者开始长乳房，所以雌激素的治疗方案也很快被推翻。现在我们知道雌激素过量会导致女性乳腺癌。因此，雌激素作为一种血脂异常治疗药物只存在了很短一段时间。
树脂从1965年就被用来降低胆固醇，信不信由你！消胆胺是一种季铵型离子交换树脂，最初由陶氏化学公司作为一种软水剂。一些聪明的医生把它作为胆汁酸螯合剂使用，并看到了一些效果。但消胆胺闻起来像腐烂的鱼，所以这个想法并没有被普遍接受。
烟酸从1955年开始被用来降低胆固醇水平，今天仍在使用。烟酸就是维生素B3，由卡齐米兹·芬克于1911年发现。当以毫克剂量服用时，烟酸就是一种维生素。但是如果以克剂量服用，它可以有效地降低胆固醇水平。大剂量服用烟酸最常见的副作用是颈部和胸部发红。
目前仍在使用的还有贝特类药物。第一个贝特类新药是ICI的氯贝特，于1958年上市。1982年，美国派德药厂的吉米罗齐作为第二个贝特类药物上市。雅培的非诺贝特于1993年被FDA批准。三种贝特类药物都非常好。但是，由于它们都是CYP450-3A4的底物，当它们与其他被CYP3A4代谢的药物一起服用，会导致药物的相互作用。
真正给胆固醇治疗带来革命性变化的是他汀类药物。这是一类通过抑制3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶来降低胆固醇的药物。
1959年，哈佛大学的康拉德·布洛赫教授建立了胆固醇生物合成的“乙酸→角鲨烯→胆固醇”级联反应。从醋酸到胆固醇的转化是一个复杂的过程，包括36个步骤和同样多的酶来促进这个过程。布洛赫与费奥多尔·莱宁共同获得了1965年诺贝尔生理学和医学奖，因为他们发现了胆固醇和脂肪酸代谢的调节机制。
如下图所示，HMG-CoA转化为甲羟戊酸酯是胆固醇生物合成的限速步骤。阻断HMG-CoA还原酶可以减少体内胆固醇的产生，这正是他汀类药物的作用原理。
他汀类药物的发现要归功于日本生物化学家远藤章。1973年，远藤章在三共公司发酵研究室工作，他发现了第一个他汀类药物美伐他汀。高剂量美伐他汀可导致狗的肠道肿瘤，所以美伐他汀未能成为一种药物上市。尽管如此，远藤章依然被称为“他汀类药物之父”。
1987年，默克公司率先将他汀类药物洛伐他汀推向市场，1991年又上市了辛伐他汀。洛伐他汀是来自发酵液的天然产物，辛伐他汀则是半人工合成的天然产物。
人们很快发现改变他汀类分子的核心结构仍然具有抑制HMG-CoA还原酶的活性。于是，全合成的他汀类药物随即出现。
山德士公司的氟伐他汀是第一个全人工合成的他汀类药物，虽然它的疗效在所有他汀类药物中不是最强的。拜耳公司推出了一种强效HMG-CoA还原酶抑制剂西立伐他汀，于1998年获批。但西立伐他汀是CYP3A4的底物，它与其他贝特类降胆固醇药物联用时特别容易引起药物相互作用，其严重结果是一些患者出现严重横纹肌溶解，甚至死亡。拜耳于2001年将西立伐他汀撤出市场，这也是拜耳在2006年关闭康涅狄格州药厂的主要原因。
最好的他汀类药物可能是美国派德药厂的阿托伐他汀（立普妥），由我的同事布鲁斯•罗斯发现。他用非常规的吡咯作为核心结构。聪明的药物设计加上运气使立普妥成为有史以来最畅销的药物。立普妥的年销售额于2007年达到巅峰130亿美元，这就是辉瑞以超过1100亿美元收购派德药厂的原因[1]。
阿斯利康的他汀类药物瑞舒伐他汀也是一个非常好的他汀类药物，于2002年批准，它是市场上最后一个他汀类药物。洛伐他汀、辛戈他丁、西立伐他汀和阿托伐他汀都是CYP3A4的底物，但瑞舒伐他汀不是。因此，瑞舒伐他汀可与其他通过CYP3A4代谢的药物联用，没有药物相互作用的问题。
瑞舒伐他汀的一个聪明的药物设计是使用磺酰胺基团替代了其他他汀类药物的异丙基基团。磺酰胺极性较高，从而避免了与CYP3A4的结合。这个聪明的药物设计为阿斯利康创造了新的知识产权。
除了刚获批的inclisiran，米泊美生是另一个已上市的用来降低胆固醇的RNA药物。米泊美生是由ISIS公司开发的反义核酸药物。该公司的名称不巧与一个恐怖组织一样，后改名为Ionis公司。
反义核酸药物是一种能与RNA单链结合的核苷酸寡聚体。米泊美生是一条合成的单链核酸，由20个核苷酸残基组成。米泊美生与编码载脂蛋白B-100的mRNA结合，载脂蛋白B-100是低密度脂蛋白的主要成分。
2013年，米泊美生被FDA批准用于治疗纯合子家族性高胆固醇血症，是皮下注射给药。遗憾的是，米泊美生一直深陷于肝脏和心血管安全问题之中，于2012年和2013年两次被EMA拒绝。2018年，米泊美生停产退市。
家族性高胆固醇血症是一种遗传性疾病，患者的胆固醇水平非常高。作为一种遗传性疾病，家族性高胆固醇血症首次被卡尔·穆勒描述为“先天的代谢错误”，会导致年轻人的高血胆固醇和心脏病发作。
20世纪60年代中期到70年代早期，人们发现家族性高胆固醇血症存在杂合子和纯合子两种类型。杂合子的患者不太严重，杂合子发生的频率为1/500。家族性高胆固醇血症杂合子患者的胆固醇水平为300–500 mg/dl，通常患者从30-40岁开始心脏病发作。而纯合子要严重得多。
幸运的是，纯合子家族性高胆固醇血症很罕见，发病率仅为百万分之一。纯合子家族性高胆固醇血症患者出生时的胆固醇水平就超过1000 mg/dl，经常在他们的童年就开始心脏病发作。
单克隆抗体PCSK9抑制剂
尽管他汀类药物取得了惊人的成功，但仍有许多患者无法达到LDL-C的目标值，而且不是所有患者都能耐受他汀类药物。PCSK9抑制剂，作为一种较新的降胆固醇药物，已显示出比现有降脂药物更大的疗效。PCSK9属于前蛋白转化酶家族，它催化分泌前体转化为活性产物。
PCSK9主要存在于肝脏，是一种由PCSK9基因编码的酶。PCSK9蛋白于2003年被发现通过调节肝细胞表面LDL-C受体的表达来调节脂质代谢。它诱导LDL受体的降解，从而降低肝脏清除血液中LDL-C的能力。LDL-C受体是迈克尔·布朗和约瑟夫·戈德斯坦于1973年发现的，他们共同获得了1985年诺贝尔生理学或医学奖。
PCSK9抑制剂逆转转化酶的功能，增加LDL-C受体的密度，从而显著降低血液中LDL-C的浓度。2006年，一位年轻的非洲裔女性被发现携带PCSK9功能缺失突变，而她的LDL-C水平低至14 mg/dL，这一水平在健康成年人中从没有见过。
这一发现令PCSK9抑制剂愈加吸引人。研究表明，大约三分之二的LDL-C通过PCSK9途径被肝脏清除。PCSK9的抑制还能降低脂蛋白-a（一种动脉粥样硬化颗粒）20–30%。因此，许多制药公司和生物技术公司都在开发PCSK9抑制剂就不足为奇了[2]。
2015年7月，阿利库单抗（普拉利）上市，它是治疗杂合子家族性高胆固醇血症的首个人源单抗PCSK9抑制剂。再生元制药公司发现了PCSK9抑制剂阿利库单抗。2009年，再生元和赛诺菲达成协议，共同开发阿利库单抗，但赛诺菲在2020年接管了全部权利。最近，再生元在冠状病毒大流行期间上市了针对SAR-CoV-2的抗体，从而真正成为了一个著名的制药公司。再生元公司的股票一直是医药和生物技术版块最赚钱的股票之一。
2015年1月，再生元/赛诺菲提交了阿利库单抗的IND申请，比安进的依洛尤单抗的IND晚一个月。但在2015年7月，再生元/赛诺菲公司灵活的策略使他们超过安进，提前获得了上市批准。他们花费6750万美元从BioMarin购入罕见儿科疾病优先审评券，将生物制剂许可证申请从10个月缩短至6个月。结果，阿利罗库单抗比依洛尤单抗提前一个月获批上市，尽管它比后者晚1个月提交上市申请[3]。
安进的依洛尤单抗是第二个人源单克隆抗体PCSK9抑制剂，于2015年8月上市。阿利库单抗和依洛尤单抗都被FDA批准用于治疗纯合子家族性高胆固醇血症[4]。
遗憾的是，第三个针对PCSK9的单克隆抗体—辉瑞的bococizumab于2015年停产，原因是注射6个月后出现（罕见且相当意外）的抗药抗体削弱了它的疗效。安进的依洛尤单抗、赛诺菲的阿利库单抗和诺华公司Leqvio均未发现有抗药抗体。
单克隆抗体PCSK9抑制剂的作用机制是: 与PCSK9催化位点结合，该催化位点位于LDL受体的结合位点旁边。结合形成氢键和疏水作用，构成空间位阻抑制PCSK9和LDL受体之间的结合。LDL受体与PCSK9之间不能结合形成复合物，从而使内化入细胞的LDL受体再循环回到细胞表面，进而行使其从血液中去除低密度脂蛋白胆固醇的功能。
PCSK9单抗与他汀类药物联用，可降低LDL-C至以前从未达到的水平——再额外降低45–60%。而且，PCSK9单抗是安全的，能带来心血管疾病的积极结果。临床试验显示，中位治疗2.2年，患者心血管事件减少15%，证实了PCSK9抑制作为治疗策略的临床益处。
单抗PCSK9抑制剂在市场上表现不佳，原因是多方面的。PCSK9单抗的一个缺点是价格昂贵。每年花费超过14,500美元，比他汀类贵100多倍。即使这两种单抗只需每两周皮下注射一次，但还是有许多病人认为不方便，它们更愿意选择更少的注射频率，或者每天口服药片。
siRNA药物
美国FDA刚批准的两种冠状病毒的mRNA疫苗引发了大众对RNA药物的极大关注。RNA的疗法也为降低胆固醇提供了更有效的治疗选择。寡核苷酸的治疗优势在于其特异性。这些药物的靶点是编码特定蛋白质的mRNA高度特异的区域，而特定蛋白质的功能为调节脂质和脂蛋白的代谢。
siRNA是一种人工合成的双链RNA分子，由20–30个核苷酸组成。siRNA通过RNA干扰诱导RNA降解。1998年Fire和Mello发现RNA干扰，彻底改变了科学和治疗界。Fire和Mello的研究表明，小双链RNAs能够选择性地沉默目标基因的翻译表达。靶向PCSK9基因的mRNA的siRNA可以减少肝脏产生PCSK9蛋白。
正如下图中弗朗西斯·克里克的中心法则所显示，siRNA降解编码PCSK9蛋白的mRNA，从而阻断PCSK9蛋白的功能。本质上，siRNA在PCSK9蛋白合成前就摧毁了目标mRNA[5,6]。
反义寡核苷酸是单链寡核苷酸，如Ionis的Kynamro。siRNA药物inclisiran是双链核苷酸，它的两条链分别充当向导和乘客。引导链包含识别目标基因的序列信息，乘客链稳定了进入RNA诱导沉默所需的RNA折叠。两条链完美协同发挥作用，降解PCSK9的mRNA。
Alnylam公司开发了inclisiran，将siRNA缀合至氮-乙酰半乳糖胺（GalNAc）形成GalNAc-siRNA缀合物，然后制备成脂质纳米颗粒（一种可生物降解的siRNA包被）。GalNAc-siRNA缀合物中的GalNAc配体可以高亲和力特异地结合肝细胞表达的唾液酸糖蛋白受体 ，并将siRNA靶向递送至肝细胞。由于GalNAc平台可将药物精确定位到感兴趣的器官（肝脏），因此可以使用低剂量药物来达到预期的治疗效果，从而降低与高剂量相关的不良反应的发生概率[7,8]。
尽管siRNA在低剂量下具有特异性和有效性，但其高度亲水性和血浆半衰期短是其全身给药的主要障碍。就像mRNA疫苗使用脂质纳米颗粒（LNP）作为理想的递送工具一样，siRNA也需要纳米递送系统。无论是纳米载体或纳米颗粒都能保护寡核苷酸，也能改善药代动力学参数。
欧洲药品管理局的批准是基于Leqvio的临床试验数据。在ORION-9临床试验中，家族性高胆固醇血症患者的LDL-C水平被药物降低了48%；在ORION-10临床试验中，动脉粥样硬化性心血管疾病的患者的LDL-C水平被药物降低了52%。该公司也在等待美国FDA的批准。诺华已经完成了FDA对inclisiran的大部分审查，现在唯一未完成的项目是生产（CMC）检查。就在今天（12月21日），美国FDA宣布：由于诺华欧洲生产基地存在问题，该药未能如计划在12月23日获得批准。这说明CMC对siRNA非常有挑战，就像大多数生物制剂一样。最终的FDA批准将不得不推迟到明年，等所有的CMC问题都得到解决之后。
尽管冠状病毒流行猖獗，EMA批准Leqvio也是适时的。在新冠病毒每天杀死数千美国人之前，心血管疾病一直是美国人的头号杀手。当我们战胜新冠病毒这个看不见的敌人后，我们又不得不重新专注于与心血管疾病的斗争。Leqvio将成为我们武器库中的重要武器，来对抗心血管疾病这个沉默的敌人。
参考文献
1.Triumph of the Heart—the Story of Statins, Li, J. J., Oxford University Press: New York, NY, 2009.
2.Iqbal, Zohaib; Dhage, Shaishav; Mohamad, Jamal Basheer; Abdel-Razik, Alaa; Donn, Rachelle; Malik, Rayaz; Ho, Jan Hoong; Liu, Yifen; Adam, Safwaan; Isa, Basil; et al. Efficacy and safety of PCSK9 monoclonal antibodies, In Expert Opinion on Drug Safety 2019, 18, 1191–1201.
3.Markham Anthony Alirocumab: First Global Approval, In Drugs 2015, 75, 1699–1675.
4.Khoury, Etienne; Brisson, Diane; Gaudet, Daniel Preclinical discovery and development of evolocumab for the treatment of hypercholesterolemia, In Expert Opinion on Drug Discovery 2020, 15, 403–414.
5.Fire, A.; Xu, S.; Montgomery, M. K.; Kostas, S. A.; Driver, S. E.; Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature 1998, 391, 806–811.