肿瘤坏死因子α（TNF-α）与TNF-α受体（TNFR）相互作用在各种自身免疫性疾病，特别是类风湿性关节炎的发病机制中起着核心作用，因此被认为是药物发现的关键靶点。然而，能够特异性阻断TNF -α-TNFR相互作用的天然化合物鲜有报道。（-）-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）是绿茶中最活跃、最丰富、研究最深入的多酚化合物。然而，EGCG改善自身免疫性关节炎的分子机制仍有待阐明。
AbMole（网页链接）精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。本期与您分享的是:靶向TNF-α-TNFR与EGCG相互作用阻断人滑膜成纤维细胞NF-κB信号传导。
本研究发现，EGCG可直接与TNF-α、TNFR1、TNFR2以相似的μM亲和力结合，破坏TNF-α与TNFR1、TNFR2的相互作用，抑制TNF-α诱导的L929细胞死亡，阻断293-TNF-α应答细胞系中TNF-α诱导的NF-κB活化，最终抑制HFLS和MH7A细胞中TNF-α诱导的NF-κB信号通路。因此，经常饮用绿茶中的EGCG可能代表了治疗TNF-α-相关疾病的潜在治疗剂。
MTT（Abmole，M7007，纯度>99%） （MTT | 298-93-1 | 美国AbMole | Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）是一种用于测定细胞增殖的试剂。
Lipopolysaccharides（Abmole，M9524） （Lipopolysaccharides | 美国AbMole | LPS）脂多糖是从革兰氏阴性菌外膜的外叶中提取的内毒素，效价大于等于500000 EU/mg。本品来源于大肠杆菌 O55:B5。
网页链接{Actinomycin D}（Abmole，M4881，纯度>99%） （Actinomycin D | 50-76-0 | 美国AbMole | Actinomycin Aiv; Dactinomycin; Act D; RASP-101）是一种从土壤细菌中分离出来的多肽抗生素。
Fig. 1. EGCG inhibits TNF-α-induced L929 cell death.
EGCG的化学结构如图1A所示。纤维母细胞瘤细胞系L929对TNF-α-介导的细胞死亡（坏死下垂）高度敏感，它经常被用作筛选抑制TNF-α功能的天然小分子的标准模型。为了研究EGCG对L929细胞活力的影响，我们首先用浓度为1.25、2.5和5 μM的EGCG处理L929细胞24小时后进行MTT实验。与未处理的对照组相比，EGCG在L929细胞中浓度高达5 μM时没有明显的细胞毒性作用（图1B）。因此，后续细胞实验中使用的EGCG浓度不超过5 μM。接下来，为了确定EGCG是否能抑制TNF-α-诱导的L929细胞死亡，在ACT-D （1 μg/mL）存在下，分别用TNF-α （10 ng/mL）或TNF-α加EGCG（0.31、0.62、1.25、2.5或5μM）处理10 h后进行MTT实验。如图1C所示，TNF-α刺激显著抑制L929细胞的活力，而EGCG处理可浓度依赖性地改善TNF-α刺激引起的细胞活力下降。与此一致的是，我们直观地观察到，TNF-α和ACT-D处理10小时后，L929细胞表现出收缩、分离和死亡，EGCG处理可以显著且浓度依赖地改善这种情况（图1D和E）。通过Annexin V-FITC /PI染色和流式细胞术分析，我们进一步证实了EGCG对TNF-α诱导的L929细胞坏死的抑制作用（图1F）。TNF-α和ACT-D处理6小时后，L929细胞的坏死率显著升高，而EGCG则显著且浓度依赖地降低了坏死率（图1G）。这些结果有力地证明了EGCG能有效抑制TNF-α诱导的L929细胞死亡。
Fig. 3. EGCG inhibits TNF-α-induced NF-κB signaling pathway in HFLS and MH7A cells.
HFLS和MH7A细胞在类风湿关节炎的发生和发展中起着关键作用，是两种广泛建立的用于评估天然抗类风湿关节炎药物的细胞模型。为了研究EGCG对HFLS和MH7A细胞活力的影响，在不同浓度EGCG作用24 h后进行MTT实验。如图3A和B所示，EGCG在5 μM浓度下对HFLS和MH7A细胞没有明显的细胞毒作用。为了进一步阐明EGCG对TNF-α-诱导的NF-κB活化的详细抑制机制，我们采用western blotting分析了EGCG是否可以抑制TNF-α处理的HFLS和MH7A细胞NF-κB信号通路的早期激活。正如预期的那样，TNF-α（10 ng/mL）处理导致HFLS和MH7A细胞中NF-κB信号通路的明显激活，通过观察到IKKα/β，IκBα和p65磷酸化水平的增加以及IκBα的降解来检测（图C-E）。有趣的是，这些效应在EGCG （5 μM）处理后60分钟内被显著抑制（图C-E）。总之，这些结果表明EGCG抑制TNF-α-刺激的HFLS和MH7A细胞NF-κB信号通路的早期激活。
通过western blotting分析确定EGCG是否可以抑制LPS诱导的HFLS和MH7A细胞的NF-κB活化。如图4所示，LPS（2μg/mL）对HFLS和MH7A细胞均有明显的NF-κB活化作用，在60 min内观察到p65磷酸化水平升高。有趣的是，EGCG（5 μM）处理对HFLS和MH7A细胞中LPS诱导的NF-κB活化没有抑制作用。
鸣谢：
Huanhuan Xu, et al. Biomed Pharmacother. 2023 May;161:114575.