2022年6月17日/医麦客新闻 eMedClub News/--线粒体作为细胞能量代谢生成ATP的主要场所，对细胞生长、增殖、分化和死亡等生命活动具有十分重要的调控作用。其在细胞中有主要有两个重要功能：一是产生超过90%的细胞能量；二是调控程序性细胞死亡（细胞凋亡）。
不论哪项功能发生不利变化时，都会产生不好的结果。线粒体功能障碍是许多药物研发失败甚至上市药物撤市的原因，每年都会有大量的新药由于在临床前研发中未能发现存在的副作用而在临床研发阶段被终结，而这些副作用多数是由线粒体功能紊乱引起的心血管和肝脏毒性作用。
随着近年来研究的深入，越来越多的研究表明，线粒体损伤是许多药物毒性作用的重要特征，并提示线粒体可能是药物毒性作用的重要靶标。
曾在Archives of Toxicology期刊上发表的一篇名为“Effects of 31 FDA approved small-molecule kinaseinhibitors on isolated rat liver mitochondria”的文章就指出小分子激酶抑制剂在治疗浓度下诱导的线粒体毒性可以预测肝毒性。
小分子激酶抑制剂是被开发的一类用于治疗癌症和其他疾病（如特发性肺纤维化）的药物。其肝毒性机制和风险因子包含代谢激活、直接的线粒体损伤、氧化应激、肝脏转运蛋白的抑制和药物代谢酶的基因突变。其中线粒体损伤被认为是药物诱导肝毒性重要的机制。近几年来越来越多的研究表明，线粒体负荷可以用来预测某一化学物质是否会诱导肝毒性。
在这项研究中，该试验的研究人员采用离体的大鼠肝细胞线粒体来测试共31种小分子激酶抑制剂的肝毒性。首先研究人员将小分子激酶抑制剂与线粒体、亚线粒体颗粒一起孵育，抑制剂的浓度范围为治疗的1~100倍Cmax（最大血药浓度）。之后测定以下指标：氧消耗率、内膜电位（MMP）、细胞色素c的释放、肿胀、活性氧（ROS）、个人呼吸链复合体（RCC)活动。
这些指标相互关联：氧消耗是线粒体最重要的功能，会受肝毒性药物的影响。小分子激酶抑制剂对线粒体氧消耗的抑制作用可能是由于其直接抑制了RCC的活动。另外，线粒体呼吸偶联会影响MMP活性，线粒体外模通透性的变化会导致细胞色素c的释放。而且线粒体正常呼吸时ROS维持在一个低水平，药物引起的氧消耗减少会导致ROS生产过剩。
试验结果显示，在这31个激酶抑制剂中，只有3个DILI阳性的激酶抑制剂在Cmax浓度下显著诱导线粒体毒性，分别为sorafenib（索拉菲尼）， regorafenib（瑞戈非尼）和pazopanib（帕唑帕尼）。在100倍Cmax浓度下，18个激酶抑制剂会引起线粒体毒性。
另外，在预测激酶抑制剂肝毒性时，线粒体毒性在100倍Cmax条件下的阳性预测值（PPV）为72%，阴性预测值（NPV）为33%，灵敏度和特异性分别为62%和44%。而在1~2.5倍Cmax条件下的PPV和特异性均为100%，NPV和灵敏度分别为32%和14%。这表明一种药如果在Cmax浓度下，因上述指标中任何一个引起的线粒体毒性，很可能是DILI阳性，然而一种药在Cmax浓度下没有线粒体毒性并不意味着DILI阴性，即激酶抑制剂的浓度在1-2.5倍Cmax时，线粒体毒性可以用来帮助鉴定其是否具有肝毒性，以作为早期的检测指标。
综上可以看出，线粒体的功能的检测在细胞毒性和药物安全性评价中有重要作用。在药物研发早期就开始进行对线粒体毒性的评估并及时发现化合物的线粒体毒性，有助于降低后续临床研究的淘汰率，大量节省研发时间和费用。
一般来说，对线粒体的评价和分析常从线粒体功能、形态以及活性氧的产生等几个方面进行：
1） 线粒体耗氧量&糖酵解检测
细胞的耗氧速率（OCR）代表线粒体中呼吸链活动强弱，细胞外酸化率（ECAR）代表细胞的糖酵解的速率，是细胞能量代谢的主要参数。安捷伦 Seahorse XF技术能够直接测量线粒体耗氧量（OCR），其已被充分证明是一种兼具特异性和灵敏性的方案。
2）线粒体功能
线粒体膜电位：线粒体在呼吸氧化过程中，将所产生的能量以电化学势能储存于线粒体内膜，在内膜两侧造成质子及其他离子浓度的不对称分布而形成线粒体膜电位(MMP)。正常的MMP是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件，MMP的稳定有利于维持细胞的正常生理功能。
活性氧（ROS）：活性氧是指生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称。活性氧与机体氧化损伤密切相关，活性氧的累积会引发衰老、肿瘤发生、动脉硬化症、黄斑变性、败血症、各种神经衰退性疾病（如阿尔茨海默氏病，帕金森病）和糖尿病等人体的许多生理和病理过程。
3) 线粒体形态及细胞纹理分析
当细胞受到药物刺激或者损伤时，线粒体的数量和分布也会发生变化。
因此，在药物的早期开发阶段进行线粒体的研究分析至关重要。本期医麦课堂携手安捷伦，将在2022年6月17日（周五）14:00-16:00上线安捷伦细胞分析Seahorse XF系列网络研讨会 第一期线上直播课程。本场主题为“药物安全毒理学中的早期线粒体筛选”，将为各位观众带来药物发现、靶标鉴定与验证等环节中线粒体毒性等活细胞代谢分析的评估方案分享。
参考资料：
1.doi: 10.1007/s00204-016-1918-1.