药苑杂谈 YAOYUANZATAN
注射剂是直接注射到人体器官、组织或血液的无菌产品，中国药典规定注射剂中不得含有任何活的微生物，因此生产过程中的微生物控制至关重要。细菌内毒素是微生物、主要是革兰氏阴性菌释放的复合物，除无菌这一重要控制项外，还应对注射剂进行细菌内毒素检测，合理控制细菌内毒素水平对注射剂安全性有重要意义。
本文将对细菌内毒素的产生、去除、检测及最新研究内容进行讲解。
一、细菌内毒素的产生与危害
细菌内毒素的本质是磷脂多糖和蛋白质复合物，主要存在于革兰氏阴性菌的细胞壁中，在细菌死亡或处于应激状态时会大量释放。由其引发的毒性反应主要包括发热反应、白细胞反应、内毒素休克。
曾经轰动一时的青霉素导致患者死亡事件，使得公众对细菌内毒素的认识更加深刻。
事情是这样的，青霉素问世后，有研究者发现青霉素对流行性脑膜炎有非常显著的疗效，青霉素立即成为当时流行性脑膜炎的首选药物，按照一般规律，用药剂量会随着病人病情的严重情况做出调整，但是在大剂量使用青霉素时却发生了患者用药后休克然后死亡的状况。原因是流行性脑膜炎的病原菌属于革兰氏阴性菌，青霉素一举歼灭脑膜炎奈瑟菌的同时，细菌内毒素因菌体死亡、包膜破裂而大量释放，造成患者发生内毒素休克，最终死亡。
细菌内毒素具有广泛的生物活性，极微量就可使人体产生发热、过敏甚至休克反应。由于细菌内毒素引发的生理学反应对人体健康危害严重，目前药品、食品、医疗器械和临床领域均对细菌内毒素进行严格控制。
二、细菌内毒素去除方法
细菌内毒素具有体积小、耐高温的特点，通过普通的除菌过滤和湿热灭菌难以清除，经过常规生产条件后在人体自然条件下仍然保持活性，因此首先就要从生产源头严格控制内毒素标准。以药品生产为例，相关制剂涉及的原料、辅料以及制剂成品中的内毒素限度都有严格要求。
生产过程中针对细菌内毒素的有效去除方法也在不断发展，包括超滤法、酸碱法、干热灭菌法、蒸馏法、离子交换法、凝胶过滤法、微波、反渗透和吸附法等等，这些方法在使用时有一定的局限性和优缺点，目前医药领域最常使用的还是超滤法、酸碱法和干热灭菌法。
即使是干热灭菌也需要在250℃条件下灭菌至少30分钟才可以去除热原。由于细菌内毒素疏水性较强，易于在容器、管道、组件和设备表面滋长，干热灭菌主要用于设备、管道、医疗器械。使用稀氢氧化钠溶液煮沸30分钟以上，也可以对部分工器具、管道进行细菌内毒素去除。
对于注射剂、生物制剂或其他不耐高温产品，优先选用超滤法去除细菌内毒素，超滤膜尺寸一般不超过0.1μm，可以有效去除细菌内毒素，但操作过程注意压力和温度控制。
三、现行细菌内毒素检测方法
产品的细菌内毒素限值一般是通过公式L=K/M计算得到的。其中M为人用每千克体重每小时最大供试品剂量，可参考药品说明书或具有权威性资料的用法用量。涉及联合用药应考虑其他制剂可能引入的细菌内毒素；儿科用药、营养不良用药和恶病质用药等，应考虑细菌内毒素对体弱患者人群可能导致更严重的影响。
注：K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以 EU/ (kg * h)表示；细菌内毒素的单位通常用EU表示，IU是细菌内毒素的国际单位，1EU与1IU相当。
关于细菌内毒素的检查方法，药典2020版《1143细菌内毒素检查法》和《9251细菌内毒素检查法应用指导原则》中都有详细的指导，即利用鲎试剂来检测或量化细菌内毒素，以期通过检测保证细菌内毒素限度符合药用质量标准。
由于革兰氏阴性菌内毒素可以迅速导致鲎血液凝固成凝胶状，因此采用鲎试剂法检测内毒素简便快捷，同时具有较高的灵敏度和特异性，鲎试剂成为理想的内毒素检测试剂。
《1143细菌内毒素检查法》主要介绍了凝胶法和光度法：
需要注意的是，如果样品中含有β-葡聚糖，则要求使用去G因子的鲎试剂进行样品检测。这是因为β-葡聚糖会和鲎试剂发生凝集反应，从而产生假阳性结果。
四、细菌内毒素研究最新进展
4.1细菌内毒素检测应用于医学领域
2023年河北医科大学第一医院肿瘤科联合临床营养科对原发性肝癌放疗患者血清中D-乳酸、细菌内毒素、二胺氧化酶含量进行检测，研究发现在肝癌患者放疗前、放疗完成时和放疗结束后一个月这三项指标的含量有明显差异，是评价肠粘膜损伤、肠道营养不良、恶性肿瘤患者术后炎症及损伤恢复程度的可靠指标。这就是说通过检测血液中细菌内毒素含量可以评价患者肠粘膜恢复情况，对于肠道营养不良和肠道菌群转移均有指导意义。
4.2细菌内毒素检测新技术
电化学分析技术在各行各业均有应用，电化学分析技术具有灵敏度高，操作简便的优点，已经广泛作为生物原件；核酸适体具有靶向性高、便于修饰的特点。浙江工业大学药学院研究者将电化学技术和核酸适体相结合对细菌内毒素进行定量分析，大大弥补现有方法灵敏度低、操作复杂的问题。
除此以外，众所周知，鲎试剂来源于鲎的血液，鲎大约在地球已经生存了4亿年，比恐龙出现的还要早，由于医药行业对鲎血液的大量采集，现在已列为国家二级保护动物，鲎血价格增长迅猛。核酸适体电化学分析技术研究如果能进行更深入的研究，代替鲎血的使用，在后期广泛用于细菌内毒素的检测，对于细菌内毒素检测将是一个很大的进步。那么被誉为“活化石”的鲎也将在地球上有更自由的生长空间。
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