卡波西肉瘤(KS)是一种影响皮肤和内脏的癌症，由卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)引起。KS是撒哈拉以南非洲地区较常见的恶性肿瘤之一，导致高死亡率。早期发现和抗逆转录病毒治疗和化疗可以减轻KS的影响，但接受组织病理学诊断是一个漫长的过程。先前是通过使用POC设备TINY对皮肤活检中的KSHV DNA进行定量诊断，然而，从患者活检中提取DNA增加了时间和复杂性，否则可以快速检测KSHV。
近日，杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Rapid, equipment-free extraction of DNA from skin biopsies for point-of-care diagnostics”的文章。在这项研究中，一种简化的、POC兼容的碱性DNA提取方法ColdSHOT被优化用于0.75 mm人体皮肤穿刺活检。优化的ColdSHOT可在1小时内从3mg样品中每5µl反应持续产生40,000+拷贝DNA，足以从KS阳性患者活检中检出KSHV。本研究的结果表明，ColdSHOT DNA提取可以简化和加速基于LAMP的亚毫米活检样本对卡波西肉瘤的诊断。
图片来源：Scientific reports
主要内容
DNA碱性提取方法
DNA碱性提取，商业上称为HotSHOT，需要95°C孵育30分钟。作为POC应用的考虑，调整方案在室温（23°C）下进行ColdSHOT DNA提取。总的来说，ColdSHOT DNA提取方法是0.75 mm皮肤活检样本在25 mM氢氧化钠中孵育1小时，然后用等体积的100 mM Tris-HCL和0.5 mM EDTA中和。
ColdSHOT DNA提取的优化
使用3 mg皮肤组织样品确定ColdSHOT DNA提取的最佳孵育时间。在25 mM NaOH中孵育(图a)，从10分钟到60分钟，DNA产量增加，每次反应的最大产量约为50,000拷贝。60分钟后，产量趋于稳定。接着，作者尝试确定皮肤组织与溶液体积的最佳比例(图b)。结果显示在低质量体积比(< 3 mg/100µl)下，DNA产率更小，变化更大。每100µl提取体积4 mg组织的比例产生最高的DNA产量，约为45,000个拷贝。随着组织体积比的提高，DNA产量略有下降并趋于平稳。
优化ColdSHOT DNA提取。图片来源：Scientific reports
ColdSHOT DNA产量分析
对ColdSHOT(环境孵育1小时)和HotSHOT(95°C孵育30分钟)提取的DNA产量进行量化(图a)。结果显示两种DNA提取方法DNA产率无显著区别。将ColdSHOT与实验室标准DNA提取DNeasy进行比较。结果显示，ColdSHOT的DNA回收率明显高于DNeasy(图b)。且实验结果表明LAMP测定不受ColdSHOT提取后样品中存在的非模板细胞碎片数量的影响(图c)。
这些实验证明了ColdSHOT与POC应用的兼容性以及与先前建立的方法的可比性，表明ColdSHOT可以在不需要重要设备的情况下，在更短的时间和更少的步骤内提供与实验室标准相似的DNA产量。
ColdSHOT DNA产量分析。图片来源：Scientific reports
ColdSHOT DNA提取率的评估
对于POC KS诊断，ColdSHOT提取的产量显示了临床准确性的潜力。在之前的研究中，用于区分KS阳性和阴性样本的基于LAMP的KSHV病毒载量为每次反应约96个KSHV拷贝。每个细胞中位数为0.67个病毒拷贝。每次反应，ColdSHOT都能产生约6,700个KSHV拷贝。考虑KS病变的异质性，平均只有49%的细胞被KSHV抗原染色。因此，使用亚毫米活检需要对KS病变进行仔细采样，以尽量减少由于采样误差导致的假阴性结果。
样品储存实验
作者进一步评估了储存条件对于ColdSHOT DNA产率的稳定性，结果显示，组织样品在ColdSHOT前储存在23°C或- 20°C保存48 h ，在TE缓冲液和PBS中保存可以很好地保留原始的DNA产量，而在RNA Later和DNA Shield中保存会降低DNA产量(图a)。ColdSHOT后的DNA中和溶液分别保存在23°C和- 20°C，在- 20°C下保存的样品在4周和几次冻融循环中显示出一致的结果(图b)。这些结果表明ColdSHOT提取与典型的样品存储方法具有良好的兼容性。
ColdSHOT DNA提取对存储条件的稳健性。
图片来源：Scientific reports
改变NaOH浓度和添加pH指示剂
ColdSHOT提取依赖于碱度，当比较浓度范围为1-100 mM的NaOH溶液时，25 mM的NaOH产生的DNA产量最高，每次反应约50,000个拷贝(图a)。在较高的NaOH浓度下观察到的较低的产率可能是由于过量的钠离子对扩增的抑制。
Tymolphthalein, O-cresolphthalein和其组合在25mm NaOH中提供强烈的颜色，中和后变为无色，并且不会显著影响DNA产率(图b, c)。而茜素黄会导致了DNA产率的轻微损失。但如果需要添加指示剂，则需注意在3周后观察到指示剂褪色。这些结果表明，添加简单的pH指示剂来清晰地识别NaOH裂解缓冲液并指示萃取物的充分中和是可行的。
ColdSHOT产量与不同的氢氧化钠浓度和添加pH指示染料。
图片来源：Scientific reports
讨论与结论
在这项研究中，一种简化的、POC兼容的碱性DNA提取液-ColdSHOT -被优化用于0.75 mm人体皮肤穿孔活检和基于LAMP的检测。无设备提取的最佳条件为:25 mM NaOH环境孵育1小时，然后加入等体积的100 mM Tris和0.5 mM EDTA。
ColdSHOT在POC应用中具有许多优点，但必须考虑几个局限性。并不是所有样本类型都适合ColdSHOT。由于不包括纯化步骤，其他需要PCR的样本类型和应用需要考察是否会抑制LAMP反应。此外，对于固体组织样本，ColdSHOT可能无法有效穿透较大的组织样本，并且可能在未消化的组织块中留下大量DNA。尽管存在这些限制，ColdSHOT仍然是一种很有前途的基于LAMP的DNA提取应用，使用的是没有已知抑制剂的小组织样本。
总之，对于皮肤穿刺活检中KSHV的POC检测，ColdSHOT是一种很有前途的DNA提取方法。
来源：小桔灯网
作者：动力彩虹