小鱼,很久没有冒泡了。
图1 P-EGFR检测流程
一
样本采集、储存及运输
1
常用采血管包括乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管,或含保护剂的专用常温采血管。建议采血量为10ml。采血后,握住采血管,立即轻柔颠倒8-10次。
禁止使用肝素抗凝管:肝素在DNA提取过程中难以去除,会降低DNA抽提得率,也会导致PCR效率降低,因此ctDNA检测血液采集禁用肝素抗凝管。
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为保证后续血浆分离及cfDNA提取质量,采血后禁止冷冻血液标本,建议常温保存及运输(6-36℃)至指定实验室。常规EDTA抗凝管应在2小时内分离血浆;含保护剂的专用常温采血管从采血至运输到实验室检测的时间间隔不超过5天。
图2 P-EGFR检测建议使用采血管二
血浆分离、储存与质控
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标本送达后,应在当日处理血液。
血浆分离时,首先2000×g离心10min,取上清;再8000×g离心10min,取上清。注意在吸取血浆的过程中,不要触及淡黄色薄层(在枪尖和淡黄色薄层之间留出5mm空隙),以防白细胞混入血浆影响检测。分离完成后,冷冻血浆直至抽提,-80℃冷冻最佳。
图3 P-EGFR检测前血浆分离流程
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血液标本分离血浆后,应进行样本质量评价,判断样本是否适合进行后续EGFR基因检测。
溶血严重的情况下,标本不可用,血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性,使PCR扩增效率明显降低。如下图样本:
图4 不同程度溶血示意图
另外,血脂过高会使血浆呈乳白色,低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用,从而对Real Time PCR造成干扰,所以血脂过高样本同样不适合检测。
图5 不同程度高血脂血浆示意图
三
ctDNA 提取、定量与储存
1
《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》(2018版)建议采用国家药监部门批准的、大容量血浆游离DNA分离试剂盒进行ctDNA提取。
2
提取ctDNA后,可根据实际情况决定是否进行核酸定量。Qubit核酸蛋白定量仪或NanoDrop 2000超微量分光光度计等仪器均是可选测量方法。
3
ctDNA提取后建议立即进行后续检测。若由于条件限制,不能立即进行后续检测而需要储存cfDNA, 首选-80℃冰箱冻存。若无-80℃冰箱,可选择-20℃保存。应尽可能缩短冻存时间,尽快进行后续检测。冻存时注意密封及标记完整,避免反复冻融。
四
EGFR/T790M 突变检测和结果判读
1
人类EGFR突变基因检测试剂盒(多重荧光PCR法)基于Super-ARMS法检测ctDNA中EGFR基因突变状态;检测灵敏度可达0.2~0.8%,是目前临床应用最广泛的EGFR检测方法。
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P-EGFR在检测前,应首先检查试剂是否齐全且完好无损,以确保实验能正常进行。试剂盒中包含试剂皆在-20℃保存,所以在加样前应保证试剂充分溶解并震荡混匀,避免因试剂中检测成分不均匀导致检测失败。
3
加样时,要注意各成分加入量的准确。例如,对于加入体积较大的成分来说应保证移液器的准确,而对于加样量较小的成分,除保证移液器的准确外,还应注意尽量将液体加入已有液体的液面之下,确保成分加入。操作应严格按照说明书要求及步骤进行,每批实验应保证与阴性对照和阳性对照同时进行检测与分析,以确保检测环境与检测试剂性能的合格。
4
加样完毕后,依据试剂盒对应耗材选择正确且匹配的荧光PCR仪进行扩增反应及荧光收集。如ABI7500,Mx3000P或SLAN-96S机型对应透明高管,而LC480或Cobas z480机型对应乳白矮管等。另外,依据不同的仪器要求进行不同的板面及程序编辑,对于有特殊要求的仪器要提前完成仪器校正。
5
结果判读应以阳性对照作为标准,严格按照说明书进行。
除以上要求外,还需特别注意实验环境的保护与清洁。检测环境清洁无污染是检测结果准确的重要保证,所以在操作过程中应尽可能保证操作的规范与正确;在实验之后也应对操作环境进行严格的清理,远离污染,放心实验。参考文献
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