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【国金医药•生物制品】MF59佐剂简述
Park0742021.09.13
MF59佐剂是一种人工合成佐剂，由4.3%的角鲨烯（三十碳六烯）、0.5%的吐温80、和0.5%的Span85组成。

MF59佐剂的研究历史：
MF59佐剂的研究始于20纪80年代末期。在当时重组DNA背景下，许多新的蛋白质抗原都可以用于疫苗制备。Chiron疫苗公司研制的HBV重组疫苗的成功尤其推动了这种微生物加铝佐剂的疫苗模式。但HBV是一种特殊的，可以自发形成高免疫原性病毒样颗粒的抗原，而其他大多数重组抗原均是可溶解的单体，并且在和铝佐剂结合后只有很弱的免疫原性。这些抗原需要比铝佐剂效力更强的佐剂来获得保护性的免疫力，如弗氏佐剂。因此，研制一种既能提高抗原的免疫原性，又可以避免像弗氏佐剂一样的反应原性佐剂就成了问题的关键。而20多年后，MF59成为第2个成功上市的佐剂，说明了这一工作的成功。

MF59佐剂的作用机制：

MF59不在注射部位形成抗原库：早期用于疫苗生产的乳佐剂是w/o的形式，通常包含不可降解的油脂，可在注射部位有效地形成1个抗原库。在针对MF59的机制研究中，研究者用放射性物质标志抗原（gD2）和角鲨烯，观察了其在兔的肌肉注射部位的运输情况。这些研究显示，被标志的角鲨烯中只有10％在注射6ｈ后仍在注射的点上，并在120h后降低至5％。同时，尽管在6h后有25％的Gd2抗原仍在注射点，120h后降低至0.05％。因此，说明MF59不同于w/o形式的佐剂，并未在注射部位形成抗原库。抗原和佐剂以不同的动力学速率被相对快速地清除。MF59激发注射部位的抗原提呈上升：早期有研究应用免疫荧光共聚焦的方法评估了小鼠中佐剂和抗原在注射部位附近组织的分布情况。肌肉注射3h后，MF59大部分在细胞外，少量可在引流淋巴结的膜下检测到，说明存在一定程度的胞外运输，可能直接通过淋巴管进行。注射后48h，MF59和抗原gD2大部分出现在注射部位的细胞内。与此同时，48h时在引流淋巴结内也出现了MF59数量增多的情况。在T细胞附近的副皮质区域也发现了含有MF59的细胞。MF59很可能是在细胞内被运输至淋巴结，这是MF59作用机制中最重要的一个途径。肌肉注射后，MF59和抗原在细胞内的共定位观察到MF59可以起到运输系统的作用，激活附近的细胞对抗原进行提呈。注射部位含有抗原的细胞对DEC205和MHCⅡ型细胞呈阳性反应，证明这些细胞是前树突状细胞。关于MF59是运输系统的假设在对分离出的人的免疫细胞进行细胞内研究时得到了证明。研究说明，MF59可以直接增强吞噬作用和胞饮作用并促进抗原提呈细胞对抗原的提呈作用。并且据推测，MF59能够作用的主要细胞类型是单核细胞，可以被募集至佐剂作用的部位，吸收抗原并参与佐剂引起的针对树突状细胞表型的分化。MF59召集免疫细胞到注射部位。MF59注射后，通过对肌肉细胞的分离，密度梯度纯化及流式细胞分析，显示出其对于单核细胞的召集作用。MF59注射后2d，分离出的肌肉部位的单核细胞增加了7倍，之后缓慢减少。这些细胞中很大一部分是F4/80阳性的巨噬细胞，少部分是CD11c阳性的树突状细胞。目前的猜测是MF59的注射促进了趋化因子的分泌，从而召集了外周血中的单核细胞。1项研究显示，CCR2阳性小鼠中的细胞流动与（无主要趋化因子受体）敲除的小鼠有显著区别。CCR2是单核细胞趋化蛋白１～５受体，表达于单核细胞上。因此，在CCR2敲除的小鼠上检测到细胞流动的增加是MF59对于细胞召集的有力说明。这项假说被另一个将MF59用作佐剂的团队进一步印证。MF59募集中性粒细胞和单核细胞进行抗原提呈并运输至引流淋巴结　将荧光标志的佐剂和模式抗原卵清蛋白（OVA）注射至小鼠体内并用流式细胞法分析肌肉和淋巴结细胞。他们检测到不同类型的免疫细胞在肌肉细胞中的重复波动，包括粒细胞和嗜酸性细胞等，及潜在的抗原提呈细胞，如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。这些细胞会在2~3周内将佐剂和抗原一同运输至引流淋巴结。MF59促进抗原在淋巴结和滤泡树突状细胞的停留　有报道，在研究MF59对疫苗抗原的促进作用时，用免疫荧光共聚焦的方法研究了抗原向小鼠淋巴结的运输情况。他们在小鼠免疫后1、6h和7d时取引流淋巴结观测。1h后，抗原就可在淋巴结的被膜下窦和髓室被检测到，至二免后，抗原全部保存在滤泡树突状细胞。同时，也检测到生发中心Ｂ淋巴细胞对抗原特异性抗体的大量分泌，而不加MF59的组别并无此现象，这说明MF59对于抗原在淋巴节中保存并提呈起到了直接作用。
MF59与流感疫苗的结合
从1990年开始，许多公司致力于研究新型的疫苗佐剂，类型包括乳佐剂、免疫刺激复合物、脂质体和微粒。Syntex公司研制的o/w乳佐剂包含角鲨烯和1种化学合成的免疫增强剂，N-乙酰胞壁酸－L－苏氨酸－D谷氨酰胺。N－乙酰胞壁酸－L－苏氨酸－D谷氨酰胺是MDP的衍生物，是分枝杆菌细胞壁中最有效的佐剂成分。但该佐剂的反应原性太强被放弃。之后Chiron疫苗公司用角鲨烯和1种化学合成的MDP做流感疫苗佐剂（MF59），也因反应原性被放弃。但根据其临床前及临床研究，MDP-PE并不是MF59作为流感疫苗佐剂所必须的成分。因此，MF59的成分确定为角鲨烯１种组分，并只针对１种目标人群是老年人的流感疫苗。
自MF59 1997年批准上市，大量的临床研究和上市后的监控研究均证明了MF59的安全性和可靠性，在应对2009年H1N1流感大流行时，也证明了其广泛使用时的可靠性。最近，在连续3个流感流行季节展开的大规模具有前瞻性的观察项目后，添加MF59佐剂的流感疫苗将65岁以上因为流感和肺炎而入院的老人的数量降低了23％。但目前在美国，有许多伊拉克退伍士兵在退伍之后患有“海湾战争综合征”的情况被与其曾接种含有角鲨烯的流感疫苗的经历联系起来，引起了一些质疑。而关于佐剂中的角鲨烯是否能够引起角鲨烯特异性的抗体，目前还存在争议。

MF59和其他疫苗的研究进展
除了在流感疫苗上的成功使用，MF59在其他疫苗的临床前研究中也表现出了免疫增强的作用。许多临床研究的疫苗都已经有加入MF59佐剂之后的评价研究，如HIC、CMV、HSV、HBV、HCV等。MF59在单纯疱疹病毒疫苗（HSV-2）的3期保护效力试验被评价为无法提供持续的保护效力。在之前的研究中，HSV-2同样没有显示出治疗性疫苗的保护效力，但错误的要求交叉保护性才是失败的关键。１个加入MF59佐剂的疫苗进入临床研究的原因是其能够引起高滴度的中和抗体和效应Ｔ细胞的反应。如果能够以这种简单的标准来评价疫苗，就能够达到疫苗研制的初衷。但高滴度的中和抗体无法提供对HSV-2感染的保护，且性传播疾病通常暴露在高病毒载量环境下。

佐剂成分角鲨烯简介
角鲨烯(C30H50)是胆固醇生物合成的中间体，是一种天然存在的高度不饱和三萜烃化合物，仅通过甲羟戊酸(MVA)或2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径形成。1916年由日本化学家辻本光丸在深海鲨鱼（Squalusspp.）肝脏中首次描述和鉴定，因此得名“角鲨烯”。自发现以来，鲨鱼肝油一直是角鲨烯的最大来源。
角鲨烯的化学结构：

角鲨烯作为抗氧化剂、抗癌剂、抗衰老剂，化学预防剂，抗菌剂，用于疫苗和药物载体和解毒剂等。因此，它是制药、化妆品行业和食品补充剂的首选。角鲨烯的作用不仅限于这些应用，而且还是数千种生物活性分子的前体，包括类固醇和藿烷。因此，许多化学、食品、化妆品和制药行业开始广泛使用角鲨烯。在过去十年中，全球对角鲨烯的需求有所增加，并引起了公众和科学界的广泛关注。2014年全球角鲨烯市场需求量约为2.67千吨，到2022年预计价值为2.419亿美元，预计主要收入来自个人护理和化妆品。为了满足对角鲨烯不断增长的需求，迫切需要以可再生和可持续的方式生产角鲨烯。
在2006年的时候，世界卫生组织科学家就已通过研究得出，在疫苗中使用含角鲨烯的免疫佐剂，可增强人体免疫应答，刺激浆细胞的成熟，让机体产生足够的抗体、对抗病毒，通过产生更强的免疫反应来提高疫苗的有效性。
角鲨烯是一种存在于植物、动物和人体中的天然物质。在人体肝脏中合成并随血流循环，角鲨烯也见于多种植物、化妆品、非处方药和健康补充剂中，市售角鲨烯提取自鱼油--尤其是鲨鱼肝油，提纯后可用于药物制品和疫苗。
基于角鲨烯的乳剂佐剂可诱导强烈的固有免疫应答，在定量和定性上增强抗原提呈，从而产生强烈的B细胞应答和抗体产生。

角鲨烯的提取
一直以来鲨鱼肝油制成的角鲨烯是最常用于疫苗佐剂，真正原因就是因为“便宜”。植物角鲨烯大约比鲨鱼角鲨烯贵30%，而且提取难度也更大。从鲨鱼身上提取角鲨烯过程只需要10小时，而获得等量橄榄油角鲨烯则需要近70个小时。

角鲨烯的功能
包括促进血液循环、活化细胞、杀菌消炎、促进伤口愈合、滋补强身、提高身体耐缺氧能力等。适合高血压、心脏病等心脑血管病人服用，也可用于提高身体免疫力和抗病能力。

角鲨烯的工作机制
佐剂与流感疫苗联合给药以增强免疫反应并加强对疾病的保护。包括MF59、AS03和AF03在内的角鲨烯乳剂佐剂已注册用于流感疫苗的给药，并在许多国家广泛使用。基于角鲨烯的乳液佐剂诱导强烈的先天免疫反应，在数量和质量上增强抗原呈递，以产生强大的B细胞反应和抗体的产生。

角鲨烯基乳液(SE)佐剂诱导产生的发光环境。SE辅助剂引入了一些细胞模型，产生相关分子模式（DAMP）信号的瞬间释放。这些DAMP信号与抗原呈递细胞细胞上的受体结合，触发细胞事件和趋化反应，导致发生级联反应。由SE触发的信号通路，导致先天免疫细胞激活摄取抗原，有效地增强免疫应答性能和抗原呈递细胞细胞的活性，从迁移到细胞反应开始有效地为B细胞反应激活系统。


经许可的疫苗与角鲨烯乳剂(SE)佐剂共同使用（截至2021.3）