研究 ·背景
淡水蓝鳌虾以无定形碳酸钙(ACC)(一种不稳定的碳酸钙变体)为主要矿物，存在于外骨骼和临时储存器官胃石中。
在评估补钙与保持骨量或减少骨折风险之间的关系时，补钙的有效性从来都不是决定性的。
研究 · 内容
受蓝鳌虾模型的启发，我们之前已经证明，与结晶碳酸钙(CCC)相比，人工合成稳定ACC给药的大鼠钙的生物利用度有所提高。
目前的研究比较了来自胃石或合成ACC的无定形钙与商业CCC或柠檬酸钙补充剂中发现的晶体钙的影响，在一个预防骨质流失的模型中。
大鼠接受假手术或卵巢切除(OVX)手术(每组20只)，然后分别给予含0.5%钙的食物颗粒，持续12周。
研究 · 结果
将 101 只 16 - 17 周大的雌性 Sprague-Dawley 大鼠 (Harlan) 分组饲养，平均体重为 250 ± 16 g（~3 只大鼠/笼）并在受控室内条件（21˚C ± 2 C和 12 小时的暗光循环）。
在 7 天的适应过程中，给大鼠喂食标准实验室饮食（#2018SC rat chow，Harlan）和去离子水。大鼠被随机分配到五个治疗组，即接受假手术的假手术组和通过双侧背侧方法切除卵巢的其他四个组 [ 23 ]，随后分为 OVX 对照、OVX-胃石、OVX-ACC 和OVX-柠檬酸盐治疗组。
手术后，给予大鼠 7 天的恢复期，让雌激素冲洗干净，在此期间，随意给予标准实验室饮食和含有 1.5 ml/400ml 双吡喃酮（Vitamed，Binyamina，Israel）和 1mg/ kg 恩诺沙星（拜耳，勒沃库森，德国）。
在恢复期结束时，根据治疗分配将大鼠分组饲养（2 只大鼠/笼）并喂食以下不同的食物混合物（表 1）：假手术（n = 19）和 OVX 对照（n = 19）大鼠喂食含 CCC 的混合物，OVX-胃石大鼠 (n = 18) 喂食含胃石的混合物，OVX-ACC 大鼠 (n = 20) 喂食含 ACC 的混合物和 OVXcitrate 大鼠 (n = 18)喂食含柠檬酸钙的混合物。
表1
Calcium content (measured by atomic absorption) in commercial crystalline CaCO3 (CaCO3), gastrolith powder from the Australian crayfish, Cherax quadricarinatus (gastrolith), synthetic stable amorphous calcium carbonate (ACC) and calcium citrate from a commercial supplement (Ca-citrate). Values are represented as mean weight %.
在整个治疗期间（90 天）随意提供补充药丸和去离子水。每周记录食物消耗和体重（表2）。
对于动态组织形态学分析，在第 76 天和第 83 天，将荧光染料钙黄绿素（20 毫克/千克体重；SigmaAldrich，圣路易斯，密苏里州）IP 注射到所有大鼠中。所有 94 只动物都有钙黄绿素双标记，由沿着小梁骨的两条不同的标记线。
第 90 天，将大鼠单独饲养在代谢笼中，禁食 18 小时。在实验结束时（第 90 天）收集尿液并储存在 -80˚C 用于脱氧吡啶啉 (DPD) 骨吸收标志物分析。提取血清样品用于骨钙素 (OC) 骨形成标志物评估，并按照第 0 天样品的描述储存。
通过吸入CO 2处死所有大鼠。解剖右股骨和第 4和第5腰椎，包裹在浸有盐水缓冲液的纱布垫中，并储存在-80˚C用于微型计算机断层扫描 (µCT) 扫描或机械测试。右胫骨被解剖并立即置于 3.7% 甲醛溶液（F1636，Sigma-Aldrich）中，在 4°C 下放置 24 小时，并按照下文结构和动态组织形态学部分的详细说明进行处理。
所有程序均经以色列贝尔谢瓦本-古里安大学本-古里安动物护理和使用委员会批准。
表2
Weight gain represents the rate of weigh increase over the course of the experiment. Mean daily food consumption was calculated per animal, by averaging the weekly food intake per cage over the treatment period and dividing it by 14. Values correspond to means (±SD). One-way ANOVA: * p < 0.01. Letters represents Fisher’s LSD post-hoc comparison tests.
使用 Skyscan 1174 µCT 扫描仪（Skyscan，Kontich，Belgium）分析右股骨和第 4 腰椎的骨小梁和皮质骨微结构。根据制造商的说明，使用密度为 0.25 和 0.75 g/cm 3的指定大鼠模型棒进行骨矿物质密度 (BMD) 校准作为标准（Skyscan）。股骨和椎骨在-80˚C 下从储存中取出，转移到用 70% 乙醇浸泡过的新纱布垫上，然后放入含有 70% 乙醇的塑料小瓶中。以 13.8 μm 的各向同性分辨率扫描每个股骨的远端区域的骨小梁和皮质骨参数。
图 1显示了来自每组的代表性右股骨远端和第 4 腰椎的基于三维 μCT 的示意性微架构重建。股骨和椎骨（分别为图 2A 和 B）假手术组的 Tb.BMD 显着高于所有四个 OVX 组（单向方差分析；p < 0.001）。
在各个OVX组中，OVXgastrolith和OVX-ACC组的股骨和椎骨Tb.BMD显着高于OVX-对照和OVX-柠檬酸盐组。股骨无明显差异与 OVX 对照组相比，OVX-柠檬酸盐组的椎体 Tb.BMD。
图1
Figure 1. Three-dimensional reconstruction of representative distal femural and 4th-lumbar vertebral cross sections. The trabecular bone region from the (A) sham-operated group treated with crystalline CaCO3 (sham). OVX-treated groups treated with: (B) crystalline CaCO3 (control), (C) gastrolith powder, (D) amorphous calcium carbonate (ACC) or (E) calcium citrate (Ca-citrate). Scale bar represents 1.5 mm. For the illustration, the femoral volume of interest (VOI) was set to 1 mm below the growth plate (most proximal boundary with the metaphysis) and extended proximally for 0.4 mm. The vertebral VOI was set to a 0.4 mm thick cross-section starting 0.14 mm below the cranial growth plate.
比较 OVXgastrolith 和 OVX-ACC 组显示，相对于后者，前者股骨 Tb.BMD 增加了 13%（图2A），尽管注意到椎骨 Tb.BMD 没有差异（图2B ）。与用 Tb.BMD 观察到的情况相反，所有组的股骨或椎骨的皮质 BMD 均未观察到显着差异（表 3(A) 和 (B)）。
股骨和椎骨 µCT 形态测量分析（图 2C 和 D 以及表 3(A) 和 (B)）显示所有 OVX 组的 BV/TV (p < 0.01) 和 Tb.N (p < 0.01) 显着下降，与到假的。
在 OVX 组的股骨和椎骨内，与 OVX 对照组和 OVX 柠檬酸盐组相比，OVX-gastrolith 和 OVX-ACC 组成员的 BV/TV 和 Tb.N 显着升高，而在OVX-柠檬酸盐和 OVX-对照组之间的 BV/TV 和 Tb.N。OVX-gastrolith 和 OVX-ACC 组成员的股骨比较显示 BV/TV、Tb.Th 和 Tb.Sp 有显着差异（图 2 C 和表 3A)，而在这两组的椎骨之间观察到的任何形态学参数都没有显着差异（图2D 和表3B）。
图2
Figure 2. Trabecular bone mineral density (Tb.BMD) and bone volume from total bone tissue (BV/TV) assessed by µCT. (A) Tb. BMD in Distal femur. (B) Tb.BMD in 4th-lumbar vertebra. (C) BV/TV in Distal femur. (D) BV/TV in 4th-lumbar vertebra. Sham-operated group treated with crystalline CaCO3 (Sham). OVX-treated groups treated with: crystalline CaCO3 (Control), gastrolith powder (Gast), amorphous calcium carbonate (ACC) or calcium citrate (Citrate). One-way ANOVA: p < 0.001. Letters represent Fisher’s LSD post-hoc comparison. Bars represent SEM.
上述在微结构结构中观察到的差异在胫骨近端的结构组织形态学分析中得到进一步强调，如表 3所示（C）。与假手术组相比，所有 OVX 组的 BV/TV (p < 0.01) 和 Tb.N (p < 0.01) 显着降低，所有 OVX 组的 Tb.Sp 均显着高于 (p < 0.01)。假组。
在 OVX 组中，与 OVX 对照组相比，OVX-gastrolith 和 OVX-ACC 组的 BV/TV 和 Tb.N 显着升高，Tb.Sp 较低，OVX 组的 Tb.Th 显着升高-ACC 组，与 OVX 对照组中的相同值相比。与 OVX 对照组相比，OVX 柠檬酸盐组的 Tb.Th 显着升高。对 OVX-gastrolith 和 OVX-ACC 组的检查显示，与 OVX-ACC 组相比，OVXgastrolith 组的 BV/TV 和 Tb.N 以及较低的 Tb.Sp 显着升高。
胫骨近端动态组织形态学分析（表 3C）显示，与假手术组相比，OVX 对照组和 OVX 柠檬酸盐组之间的 BFR/BS 升高了 13%；然而，这并没有达到统计数字cal 意义。然而，OVX-gastrolith 和 OVX-ACC 组的 BFR/BS 比值显着高于假手术组的相同参数（p < 0.01）。
表3
(A) Distal femurs metaphysic; (B) 4th-lumbar vertebra; (C) Proximal tibia structural parameters (analyzed in 4 µm-thick MacNealstained sections) and dynamic parameters (analyzed in un-decalcified sections double-labeled with calcein); (D) Biochemical markers. Trabecular number (Tb.N), trabecular separation (Tb.Sp), trabecular thickness (Tb.Th), cortical bone mineral density (Ct. BMD), bone formation rate/bone surface (BFR/BS), mineral surface/bone surface(MS/BS), mineral apposition rate (MAR), Dihydropyrimidine (DPD), osteocalcein (OC). Values correspond to means (±SD). One-way ANOVA: * p < 0.01.Letters represents Fisher’s LSD post-hoc comparison tests.
与假手术组相比，OVX 对照组和 OVX 柠檬酸盐组之间的 MS/BS 比率没有改变，而 OVX 胃石和 OVX-ACC 的 MS/BS 比率相对于假手术组升高（p < 0.01） .
在 OVX 组中，与 OVX 对照相比，OVX-gastrolith 和 OVX-ACC 组的 BFR/BS 和 MS/BS 比率显着提高。OVX-柠檬酸盐组的 BFR/BS 和 MS/BS 比值与 OVX-对照组的测量值相似，显着低于 OVX-gastrolith 和 OVX-ACC 组的测定值，而 MAR 无显着性差异所有治疗组之间的差异。
表 3(D) 和 (E) 中给出了在第 0 天和第 90 天对所有治疗组中骨转换的评估，如 OC（一种形成标志物）和尿 DPD（一种吸收标志物）的水平所反映的。当在随机化前的基线（即第 0 天）评估两种标志物时，发现治疗组之间没有统计学差异（表 3 (D)）。
在第 90 天（表 3(E)) 然而，与假手术组相比，OVX-对照、OVX-胃石和 OVX-柠檬酸盐组中观察到显着更高的 DPD 水平 (p < 0.001)，而 OVX-ACC 组中的 DPD 水平为与假手术组没有统计学差异，但显着低于 OVX 对照组和 OVX 柠檬酸盐组。OVX-gastrolith 组的 DPD 水平显着低于 OVX-柠檬酸盐组，但与 OVX-control 或 OVX-ACC 组无差异。血清 OC 标志物水平在各个实验组之间没有显着差异。
与假手术组测量的值相比，第 5腰椎的机械强度分析显示出显着较低的值，即 OVX 对照组、OVX 胃石组和 OVX 柠檬酸盐组的平均 40%（图 3A-C ; p < 0.01)。同时，OVX-ACC 组的大部分机械强度值仅比假手术组测定的值平均低 17%。
有趣的是，OVX-ACC 组的极限力参数与假手术组没有显着差异。在 OVX 组中，与所有其他 OVX 组相比，OVX-ACC 组在每个测试参数（包括极限力（图 3 A）、极限力能量（图3））中呈现出显着更高的值B)和韧性(图3C )。
图3
Figure 3. Lumbar vertebrae mechanical strength and microarchitectiral properties. (A) Ultimate Force; (B) Energy to ultimate force; (C) Toughness; (D) TBPf; (E) SMI; (F) DA. Sham-operated group treated with crystalline CaCO3 (Sham). OVX-treated groups treated with: crystalline CaCO3 (Control), gastrolith powder (Gast), amorphous calcium carbonate (ACC) or calcium citrate (Citrate). One-way ANOVA: p < 0.01. Letters represent Fisher’s LSD post-hoc comparison. Bars represent SEM.
由于压缩测试不仅受骨密度影响，而且受微结构拓扑结构和椎体方向的影响 [28-30]，我们进一步寻求确定这些大鼠椎体内的小梁拓扑结构和方向参数。
第 4腰椎的显微 CT 分析显示，与所有 OVX 组相比，假手术组的 TBPf 较低。在 OVX 组内，OVXACC 组的 TBPf 显着低于 OVX-对照、OVX-柠檬酸盐和 OVX-胃石组（图 3D; p < 0.001)。
SMI 评估指向相同的趋势，与所有 OVX 组相比，假手术组显着降低。
在这里，OVX-ACC 组获得的值显着低于 OVX-对照和 OVX-柠檬酸盐组的测量值。同时，OVX-ACC 组获得的 SMI 值相对于 OVX-gastrolith 组测量的指数有所降低（图 3 E；p < 0.001）。
与 OVX 对照、OVX-胃石和 OVX 柠檬酸盐组相比，假手术组最后测量的微结构参数（即 DA）平均低 22%。假手术组和 OVX-ACC 组之间或所有 OVX 组之间没有观察到 DA 的显着差异，尽管 OVX-ACC 显示的值低于其他 OVX 组（图 3F; p < 0.001)。
本研究的结果表明，与两种市售钙补充剂（即碳酸钙和柠檬酸钙）相比，天然 ACC（即蓝鳌虾来源的胃石粉）和合成 ACC 治疗可显着预防 OVX 引起的骨质流失。
与 CCC 和柠檬酸钙治疗相比，通过 μCT 和结构组织形态学研究，观察到胃石和 ACC 的形态测量骨参数显着增加。
与其他治疗相比，胃石和 ACC 治疗均显示出增加的骨形成率，如动态组织形态计量学所示，对血清 OC 水平没有影响。
有趣的是，与其他治疗相比，尿 DPD 水平表明合成 ACC 具有抗吸收作用，这项研究的结果与我们的基本假设一致，即天然和合成的 ACC 对骨骼都有有益的影响，这源于 ACC 在其分析和自然形式并进一步支持我们之前的报告，显示合成稳定 ACC 的生物利用度高于 CCC [ 20 ]。
在 OVX 对照组和 OVX 柠檬酸盐组中观察到最显着的骨质流失，这表明目前可用的钙补充剂预防骨质疏松过程的能力有限。
在本研究中评估的几乎所有参数中，使用这两种补充剂中的任何一种都没有观察到显着差异，这支持了碳酸钙和柠檬酸钙与食物一起服用时对骨骼的吸收和影响相似的观察结果 [2 ,3]。有趣的是，与对照或柠檬酸盐治疗相比，胃石和合成 ACC 治疗均显着减少了股骨、胫骨和椎骨的骨质流失。
研究 · 结论
微计算机断层扫描(pCT)和组织形态学分析显示，与两者相比，胃石治疗和ACC治疗都能预防骨丢失，表现为骨形态学参数的增加CCC-和柠檬酸钙处理组。
动态组织形态计量学参数表明，与CCC或柠檬酸钙治疗相比，胃石和ACC治疗均导致胫骨松质骨形成。尿脱氧吡啶啉(DPD)水平提示ACC具有抗再吸收作用，这也是唯一能导致椎体机械强度显著增加的治疗方法，pCT分析椎体小梁的拓扑结构和方向参数支持了这一点。
据我们所知，通过补钙来预防骨质流失的这种程度还从未被报道过。因此，这些发现表明天然(蓝鳌虾胃石)和在更大程度上人工合成ACC来源都有可能预防代谢性骨骼疾病和可能的骨质疏松过程。
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