新药启航 关注新药启航微信公众号，带你看更多新药研发前沿资讯。
去年的12月12号，百利天恒宣布与百时美施贵宝（BMS）达成一项高达84亿美元的合作协议，引进其HER3/EGFR双抗ADC产品BL-B01D1。这一交易不仅创造了国产ADC药物出海授权的新纪录，也是首款成功出海的双抗ADC新药，彻底点燃了大家对于双抗ADC药物开发的兴趣。这个月刚刚结束的AACR 2024会议，双抗ADC也是有史以来最多的一届会议（表1），让原本已经非常火爆的ADC赛道再度升温。
虽然目前双抗ADC非常火热，但笔者还是要给大家泼一盆冷水，不能因为眼红就什么靶点胡乱组合一通。即便是目前研发进度最领先的BL-B01D1，我们也要问一问这个产品它到底解决了什么问题，特别是单个靶点有成药潜力的情况下，我们更应该思考双抗ADC的价值是什么？在笔者看来，无论什么价值最终都将体现在临床价值和成药潜力这两个方面。以BL-B01D1为例，与单靶点ADC相比，是否解决了靶点本身问题如HER3表达稳定性差？EGFR肿瘤特异性有限？是否能提高安全性？扩大覆盖人群？疗效有提升？只有把这些问题都想清楚了，哪怕是能解决其中任何一个问题，那这个双抗ADC就值得去做。
笔者对目前进入临床研究阶段的双抗ADC所用结构进行了总结归纳（表2），有5家公司选择了和单抗最为接近的不对称IgG作为双抗结构，包括了康宁杰瑞、Regeneron、轩竹生物、AstraZeneca和信达生物，不对称IgG实现路径较为多样，康宁杰瑞用到了共同轻链和CRIB重链技术，AstraZeneca和信达都用到了KIH和轻链二硫键移位技术，轩竹生物则使用了共同轻链和knob-into-hole (KIH)，Regeneron则是其专业的共同轻链和重链ProteinA结合去除技术；另有4家企业使用Fab-scFv这种不对称IgG-like双抗结构，分别是默克、Zymeworks、正大天晴和Immunogen。
Fab-scFv是目前较为常见的一种双抗结构类型，重、链错配问题可以使用没有专利限制的KIH技术解决，轻链部分因为采用了scFv，因此不存在重轻链错配的问题。需要特别指出的是因为scFv的使用，如果使用非定点二硫键半胱氨酸偶联，那么理论DAR值最多只能做到6；目前只有Abbvie的PSMA-STEAP1双抗ADC目前还没有信息披露，无法确定其双抗结构，不过Abbvie也是双抗领域最早的玩家之一，著名的DVD-Ig双抗结构由Abbot (AbbVie前身) 公司研发，在正常抗体的轻重链可变区N端分别再连接上另一个抗体的轻链可变区和重链可变区，形成具有双可变区抗原结合位点的抗体。
从抗原靶点结合的avidity上来说，几乎所有的双抗ADC都是单价结合即1:1的形式，唯一的例外就是BL-B01D1，BL-B01D1采用了IgG-scFv的双抗结构，通过将结合第二抗原的scFv结构与IgG抗体重链C末端融合表达，即可轻易得到IgG-scFv双抗，这种双抗结构的优势在于不需要考虑常见的重链-重链以及重链-轻链错配问题，所以技术门槛相对较低且没有专利限制，而且这是一种典型的2：2抗原靶点结合模式，理论上拥有更高的靶标结合avidity。
那么双抗ADC的抗体结构到底需不需要进行系统设计优化呢？我想这个答案是肯定的，只是限于各家公司在双抗技术方面的储备情况不太相同，所以很多原本没有双抗技术的ADC公司在开发双抗ADC时，首先想到的抗体结构就是Fab-scFv或IgG-scFv这种没有专利障碍的IgG-like结构类型。在今年刚结束的AACR会议上，双抗ADC领域的老玩家Zymeworks（没错，就是那个几年前把Her2双抗和Her2双抗ADC授权给百济神州的那家），展示了一份关于双抗结构设计优化的海报，下面笔者就对海报的核心内容给大家做逐一解读。
Zymeworks这次的双抗ADC选择的靶点分别是针对卵巢癌的NaiP2b和FRa。FRa作为已上市的卵巢癌ADC靶点，单抗ADC在FRa高表达人群效果较好，而对FRa低表达人群疗效较差，NaiP2b是卵巢癌未完全临床验证的一个ADC靶点。Zymeworks首先对选择NaiP2b和FRa这两个靶点的逻辑进行了论证，数据表明NaiP2b和FRa在肿瘤组织表达存在显著差异，有的病人NaiP2b表达高，有的FRa高，也有的病人两个靶点同时高表达，这样就为两个靶点的组合提供了合理的依据。没有提供正常组织两个靶点表达的情况，这样做会不会把两个靶点的毒性叠加呢？比如肺毒性...
在靶点确定以后，Zymeworks对双抗结构进行了系统设计和优化，整体看结构方面全部采用了不对称IgG-like样结构，包括1:1，2：1和2：2三种类型，全部基于Zymeworks自研的Azymetric双抗平台进行开发，Azymetric平台通过在抗体CH3结构域中引入两组突变，从而提高双抗的重链正确配对比例。
做过ADC的朋友都知道，抗体的结合表位对于ADC药物表现有比较大的影响，主要体现在靶点占有率和内吞速率方面，进而对ADC的药效和代谢产生显著影响。在Zymeworks的海报中，对NaiP2b和FRa靶点的抗原表位方面，也进行了系统研究对比，其中NaPi2b结合臂只有一种表位，克隆号12A10，12A10对应的全抗和半抗体的细胞FACS亲和力分别是0.7nM和3，4nM; 而FRa结合臂存在3个不同的结合表位，克隆号分别是10L18、76和2L16，3个克隆号对应的全抗细胞FACS亲和力分别是0.2nM、2.9nM和0.6nM。
基于1:1，2：1和2：2三类不对称IgG-like双抗结构，以及靶点结合表位组合，总计设计了48种双抗分子，首先对这48种双抗分子的表达量和产品纯度进行了表征。SEC纯度方面几乎所有的双抗主峰含量均大于85%（未明确说明是几步纯化），可以看出所有双抗分子纯度都比较高。
紧接着，对所有双抗ADC的三个重要技术指标：细胞结合能力、内吞活性和细胞杀伤活性进行了系统研究，并且选取了FRα和Napi2b不同表达丰度的肿瘤细胞进行检测。在进行细胞杀伤活性测试前，Zymeworks首先利用半胱氨酸偶联方式进行了ZymeLink™ Auristatin ADC样品制备。对于两个靶点共同高表达的细胞系，不同的双抗结合能力差异较小，而且无论是采用scFv还是Fab作为抗原binding motif，细胞杀伤活性的potency都表现出类似的趋势，那就是更高的avidity具有更强的杀伤活性，即2:2>2:1>1:1；包含10L18 FRα 抗原结合表位的双抗ADC相比于包含76或2L16 FRα抗原结合表位具备更强的杀伤活性；研究还发现双抗ADC如果含有双价的NaPi2b，双抗ADC活性显著优于单价NaPi2b的形式；不仅如此，系统的对比实验提示在2: 2这种双抗结构形势下， N端Fab比 C端Fab结构具备更强的细胞杀伤活性，百利天恒的BL-B01D1相当于是C端scFv，不知道百利天恒当初进行分子设计时是否测试过N端scFv这种结构类型。
Zymeworks利用FRα和Napi2b双抗ADC项目对于双抗ADC的结构设计以及抗原表位选择等问题进行了系统研究，对于双抗ADC项目开发具备重要的借鉴意义。但同时我们也应该注意到这篇文章的局限之处，整个研究全部是基于体外研究，并且所采用的ADC策略是Zymeworks公司自己的ZymeLink™ Auristatin平台，平均DAR=2。缺乏体内数据的支持，单纯依靠体外数据很难确定到底哪种设计是最有可能成药的分子，而且不同公司的ADC平台本身也有非常大的差异。所以合理的流程应该是结合各个公司的双抗技术储备和具体靶点组合，通过系统的设计和体外研究确定为数不多的几个不同形式的双抗ADC进入体内研究，然后结合体内药效-PK-PD-毒理数据进行系统分析和解读，找到最优的分子进行后续开发。