解析一种可靠的协同双特异性策略，旨在挽救针被SARS-CoV-2逃逸变体（包括BA.2.86、EG.5.1和JN.1）失效抗体。
Deciphering a reliable synergistic bispecific strategy of rescuing antibodies for SARS-CoV-2 escape variants, including BA.2.86, EG.5.1, and JN.1
Authors
Zhou Tong, Jianyu Tong, Wenwen Lei, ..., Guizhen Wu, Jing Lou, George Fu Gao
doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114338
免责申明：本文翻译工具为通义千问，原文不存在的所有内容都是它加的。不要找发文的人的责任。
亮点：
利用协同效应构建的双特异性抗体（bsAb），旨在挽救被病毒变种逃逸的母本单克隆抗体（mAbs）。
结合RBD-8和RBD-5抗体的单链双域（scDb）结构加速了RBD-8的暴露。
狭窄的抗原结合位点跨度对于复制协同效应至关重要。
RBD-5 scDb与RBD-2、RBD-4、RBD-6及RBD-7的组合显示出类似的效果。
Paring 大概是海选；Span 大概是对比验证。
Diabody（双链抗体）是一种基因工程抗体，是单链抗体片段(scFv)技术发展出来的一种特殊类型的抗体结构。它由两个不同的或相同的scFv通过短链肽连接而成，每个scFv由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成，通过一个短的连接肽相连，形成了一个非共价的小分子二聚体。
图地下的中和效力数值：前2排是单个使用；第3排是勾兑联用，数值介于二者之间；第4排是改造后的效力。
总结：
治疗性单克隆抗体（mAbs）与持续出现的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）变异株之间的博弈目前倾向于病毒一方，因为大多数治疗性mAbs已被变异株逃逸。针对这一挑战，本研究系统地探索了一种可复制的双特异性抗体（bsAb）依赖的协同效应。当bsAb的任意单个mAb被变异株逃逸时，该协同效应能有效恢复bsAb的中和活性。这种协同主要归因于受体结合域（RBD）-5的结合角度，它促进了刺突间的交叉连接，并促进了经典抗体组合使用无法实现的隐蔽表位暴露。此外，RBD-5与RBD-2、RBD-6、RBD-7以及RBD-8的组合也展现出显著增强的效果。本研究不仅转变了对抗体相互作用理解的范式，还为开发针对快速变异的SARS-CoV-2更有效的治疗性抗体铺平了道路，其中Dia-19已显示出对诸如BA.2.86、EG.5.1和JN.1等新兴变异株的潜力。
（RBD1-8应该是高福组对于RBD区域的划分，相对于早期的1/2/3类抗体和后期4/5类更加精准；类似于曹云龙的A1 A2 B C D1 D2 D3 D4 E1 E2.1 E2.2 E3 F1 F3, SA55是F3区域的1类抗体即靶向RBM抗体。）
（1/4类抗体 归类F3
1类抗体归类A1 A2,
2类抗体归类B C D1，
3类抗体 归类D3 D4 E1 E2.1 E2.2，
5类抗体 归类E3）
1类 RBD的尖顶，只有融合前状态可以结合
2类 RBD三聚体的内侧（上部），融合前后状态都可结合
3类 RBD三聚体的外侧，融合前后状态都可结合
4类 5类不是很懂～～ 4类貌似RBD三聚体内部下面，融合前可以结合 5类貌似RBD三聚体外侧下端
doi.org/10.1101/2020.08.30.273920
引言
为治疗目的而开发的抗体在救治因严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染而住院的患者中发挥了关键作用。【1-7】最初，这些抗体的开发主要集中在SARS-CoV-2刺突（S）蛋白上的受体结合基序（RBM），可以直接干扰受体结合域（RBD）与宿主细胞上的细胞受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的相互作用。【8,9】
然而，RBD中的主导抗原位点不可避免地导致接触ACE2受体的RBM成为SARS-CoV-2关注变异株（VOCs）的逃逸突变热点。【10-16】针对非RBM区域的抗体，包括RBD的外表面、内表面的隐蔽表位和背面区域，发现具有相对持久的活性。【13,17-21】然而，SARS-CoV-2的快速进化最终引入了非RBM区域的突变。【21,22】最近出现的奥密克戎BA.2.86谱系相比于B.1.1.7 Alpha VOC，在其RBD上有25个额外的突变，比其BA.2前身多出14个。【23】值得注意的是，这14个突变中有12个位于非RBM区域，给单克隆抗体（mAb）的开发带来了重大挑战。【12,23】
除了寻找不同病毒变异株表面蛋白表位的保守性之外，另一种方法是结合至少两种中和抗体，以提供更广泛的表位覆盖和增强的抗变异能力。【4-6,24-27】理论上，一个最优的抗体组合可以产生协同效应，显著超越母本mAbs的中和能力。（应天雷教授：有人在夸我的BN03。摘出官能团链接成双截棍结构，比2种抗体联用还好。）【24,25,28,29】越来越多的双特异性抗体构建体，通常用于癌症治疗，现在正被引入以寻求针对SARS-CoV-2的协同效应。【25,27,28,30】我们之前的研究调查了一种双特异性单链双域（scDb），【56-65】，结合了两种抗体BIOLS56（RBD-8）和IMCAS-L4.65（RBD-5），以应对病毒从单一抗体逃逸的挑战。【31】该56-65 scDb显示出了相对于原本抗体显著的中和效力增加。
相比抗体组合使用，（56-65 scDb）对抗体逃逸变异株的中和活性有显著提升。（参见开头图的数据）阐明如何在不同抗体间复制这一效应的条件，对于确定这种mAb配对观察到的协同效应是否可扩展到其他抗体至关重要。然而，由于IMCAS-L4.65和BIOLS56对SARS-CoV-2变异株广泛的交叉中和活性，这些mAbs的强大效力阻碍了我们准确测量可能浮现的潜在协同效应。因此，我们探索了与免疫球蛋白G（IgG）相比的双体型的特性，并从双体型噬菌体展示库中鉴定出与IMCAS-L4.65和BIOLS56具有相似结合位点的抗体。通过结合这些展现不同中和谱的mAbs，我们加深了理解这类组合如何能加速隐蔽表位的暴露并促进S蛋白的快速交联，从而增强了对各种抗体组合和双特异性抗体格式下如何实现协同效应的认知。
总之，我们的发现对于改造抗体，特别是mAbs，以对抗像SARS-CoV-2这样快速变异病毒的逃逸具有至关重要的意义。
（令病毒面对一堵叹息之壁，极大可能降低逃逸抗体和高效传染能力兼顾的路线，就像BD55-1205那样的；不能筑起屏障，会出现临床中被脱靶的惨剧，例如DXP604/593 BRII196/198导致十位数的巨额经济损失）
结果
通过双特异性噬菌体展示库揭示协同效应关键证据的策略
为了寻找那些结合相同表位却能选择性地中和SARS-CoV-2特定变异株亚群的抗体，我们使用了从感染SARS-CoV-2原始株的康复患者（n=12）样本构建的双特异性噬菌体展示库。32双特异性噬菌体库的选择基于其与scDb结构的相似性，以及利用双特异性分子的更高亲和力来高效增加非RBM表位抗体产量的能力（图S1）。
图S1. 通过双链抗体噬菌体展示文库发现三种非RBM抗体的优化策略。
A) 使用基于双链抗体的噬菌体展示文库来增强低丰度非RBM抗体的发掘。我们设计了一种并行生物淘选策略，旨在减轻因双链体增强的亲和力导致的非特异性结合，并在非RBM区域识别隐蔽表位的抗体。我们针对不同目标物进行了三轮生物淘选：SARS的RBD、原型RBD，以及Beta和Omicron BA.4/BA.5变异株的RBDs。在最后一轮中，所有单克隆噬菌体被测序。随后，我们利用hACE2与PT-RBD竞争试验分析所有占优势比例的克隆型，从中鉴定出三种非RBM结合候选抗体。
B) IMCAS-123、IMCAS-364和IMCAS-316的序列比对。IMCAS-123源自VH3-23 D3-10 J1 / VK1-12 J4胚系家族，是一种人IgG1κ型抗体，其VH基因存在非体细胞突变，VL基因有九处突变。IMCAS-364源自VH3-33 D2-8 J4 / VK1-39J4胚系家族，同样为人IgG1κ型抗体，包含VL基因的无症状突变和VH基因的三个突变。IMCAS-316源自VH3-30 D5-18 J4 / VK1-33 J4胚系，含五处VL基因氨基酸突变和三处VH基因氨基酸突变。此外还提及了IMCAS-L4.65和BIOLS56两种抗体的来源及其基因突变情况。这些序列比对由ESPript软件生成。
C) 利用指定的凝胶过滤柱在PBS缓冲液中进行IMCAS-123、IMCAS-316和IMCAS-364的尺寸排阻色谱分析。随后使用SDS-PAGE分析色谱峰中的蛋白样品。
我们进行了表位竞争实验，使用了Hastie等人最初描述的来自七个表位组（RBD-1至RBD-7）的特征明确的mAbs，以及识别S蛋白上“动态”隐蔽表位BIOLS56，该表位被定义为RBD-8（图1A和S2A）。17,31我们鉴定了一个抗体IMCAS-123，它与IMCAS-L4.65结合相同的表位；另外两个抗体IMCAS-364和IMCAS-316与BIOLS56结合相同的表位（图1B和S2B）。与IMCAS-L4.65不同，IMCAS-123部分被奥密克戎BA.1逃逸，完全被XBB.1逃逸。
图1(A) 详细表位竞争测定描绘了三种非RBM抗体（IMCAS-123、IMCAS-364、IMCAS-316）、IMCAS-L4.65以及BIOLS56之间的相互作用，并进一步与Hastie等人提出的另外六个表位组抗体进行对比。实验数据来源于三个独立实验。参见图S1以获取更多信息。
S2.(A) 使用BLI（生物层干涉技术）测量mAbs（单克隆抗体）对SARS-CoV-2 RBDs（受体结合域）的竞争性结合。
IMCAS-364和IMCAS-316显示出对所有流行的的SARS-CoV-2 VOC的RBD以及GX/P2V/2017、GD/1/2019、RaTG13和SARS-CoV-1 RBD的稳定结合能力。然而，与BIOLS56不同，IMCAS-364在奥密克戎BA.1变异株之后几乎丧失了对抗后续变异株的所有中和能力。尽管IMCAS-316显示出与BIOLS56类似的针对SARS-CoV-2变异株的中和能力，但值得注意的是，它对抗SARS-CoV-1的中和效果显著降低（图1B和S2B）。
(B) 对三种分离出的非RBM抗体进行了全面分析，重点展示了它们对一系列SARS-CoV-2假病毒的结合亲和力及中和能力。结合常数(KD)和半数抑制浓度(IC50)值均为三个独立实验的平均数据。详情请参阅图S2。
S2.(B) 本部分讨论了三种非RBM单克隆抗体（IgG形式）与当前循环的所有SARS-CoV-2 VOC（值得关注的变异株）的受体结合域（RBDs）之间的结合亲和力及中和活性。所列数值代表三个独立实验的平均值±标准误（SEM）。
（再次验证了曹云龙的结论 对原始株最强结合的不一定拥有极好的抗变异能力，容易导致研发半途脱靶）
通过结构分析，我们确认了三个鉴定抗体IMCAS-123、IMCAS-364和IMCAS-316与RBD复合物的结合位点符合我们的预期（图1C、S3和S4）。
图1 (C) 本部分涉及三项非RBM抗体的表位映射；在RBD内部，标记出了关键接触残基（距离小于4.5埃）。详情请参考图S3和图S4。
S3 S4欠奉
双特异性假病毒实验为揭示协同效应的机制提供了重要证据。我们发现，IMCAS-123双特异性体表现出与IMCAS-123 IgG相当的中和活性。这种意料之外的活性增强并未在IMCAS-364或IMCAS-316的双特异性体中观察到，暗示了IMCAS-123双特异性体可能具有的特定中和机制（图1D和S1C）。先前的研究表明，SARS-CoV-2 S蛋白在病毒表面的距离与IgG两个Fab臂的宽度相近，这增强了IgG的中和效率。【17】由于双特异性体中两个抗原结合位点（ABS）的宽度短于IgG Fab臂间宽度，似乎合理推测IMCAS-123双特异性体可能采用了除IgG机制之外的额外中和机制。
臂间宽度 就是下面抗体那个Y型，上半边，2个枝桠之间的距离的意思。
图1 (D) 本部分对IMCAS-123的不同结构形式（包括IMCAS-123 Fab片段、双链体、F(ab')2片段以及IgG全分子）针对典型SARS-CoV-2的中和能力进行了比较评估。图中，黄色高亮显示IMCAS-123双链体表现出与IgG相似的卓越活性。为了进行精确的对比分析，已经考虑了各结构间分子量的差异，并将数据以统一的纳摩尔(nM)浓度呈现。每次中和实验均重复进行了三次，每次有两个复制品（n=2）。报告的IC50值为三个独立实验的平均数据。
图S1 (C) 部分内容描述了使用指定的凝胶过滤柱在PBS缓冲液中对IMCAS-123、IMCAS-316和IMCAS-364进行的尺寸排阻色谱（Size-exclusion Chromatography, SEC）分析。在SEC实验之后，通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）进一步分析了得到的色谱峰，以确定蛋白质的纯度和亚单位结构。
IMCAS-123促进隐蔽表位的暴露
为了阐明抗原结合位点宽度减小是否与通过56-65 scDb（单链双域）观察到的针对逃逸变异株中和活性恢复存在因果关系，我们将IMCAS-123与IMCAS-364融合成一个与56-65 scDb结构统一的分子。鉴于IMCAS-364对抗奥密克戎变异株的中和能力丧失，通过观察123-364 scDb相对于IMCAS-123 IgG对抗相同奥密克戎变异株是否展现出更高的中和活性，我们可以准确评估协同效应的发生（图2A和S5A）。双特异性123-364 scDb显示出比IMCAS-123 IgG显著更高的中和活性，特别是在针对奥密克戎变异株BA.1.1和BA.4时。这种增强在单特异性123-123 scDb格式和IMCAS-123加IMCAS-364组合使用中是不存在的（图2A）。此外，我们将123-364 scDb与IgG1的结晶片段（Fc）偶联，形成了分子大小类似于IgG的scDb-Fc同二聚体（图2A，S5A和S5B）。随后的假病毒和真实SARS-CoV-2感染试验证实了scDb与scDb-Fc之间具有相似的中和活性（图2A和S5C）。这一结果表明，观察到的协同效应主要源于scDb（单链双域）而非IgG。
这张图依旧表明了，脱靶抗体和未脱靶抗体勾兑，会降低中和效力，工程化的双官能团链接法远优于勾兑法。
2个单抗株分别测试，2个单抗株勾兑测试，单价官能团连接体，二价官能团连接体，二价二价官能团的改造单抗
图2 (A) 此部分内容通过图示详细解释了从双链体(diabody)到单链双特异性抗体(scDb)，最终形成类似IgG的scDb-Fc结构的发展过程。同时，提供了一张表格，汇总了多种双链体及其构建体针对特定奥密克戎(Omicron)变异株的假病毒中和效果指标。图中，黄色高亮部分强调了当与IgG或混合抗体配方相比时，显示出的显著协同效应。在分析中考虑了分子量的变化，并将所有结果以统一的纳摩尔(nM)单位呈现。每个中和实验均重复进行了三次，每次实验设置两份复制品（n=2）。报告的IC50值为三个独立实验的平均数据。更多相关信息请参见图S5。
图S5 (A) 抗体结构的示意图表示。 VH 重链可变区 VL轻链可变区
图S5 (B) 使用指定的凝胶过滤柱在PBS缓冲液中对scDb和scDb-Fc进行的尺寸排阻色谱分析。
为了理解在scDb格式下IMCAS-364是如何在IMCAS-123的帮助下重新获得对抗奥密克戎变异株的中和活性，我们设计了一个实验，分别使用IMCAS-123 Fab、IMCAS-364 Fab、IMCAS-123 Fab + IMCAS-364 Fab混合物以及123-364 scDb与含有突变S1-S2切割位点（RRAR变为GSAS）的BA.1 S蛋白单独孵育（图2B和S5D）。设置了同样带有该突变的原型（PT）S作为对照组。IMCAS-364 Fab未能与BA.1-S形成复合物，表明无法接触到隐蔽表位。相比之下，123-364 scDb与BA.1-S和PT-S形成了相同的高分子量峰，提示IMCAS-123的结合帮助IMCAS-364接触隐蔽表位，形成了S-scDb多聚体。在IMCAS-123 Fab + IMCAS-364 Fab混合物中没有观察到这种恢复，强调了scDb格式的必要性。
图2(B) 本部分介绍了一个体外结合实验，用以展示双特异性抗体与刺突蛋白的结合情况；图中，蓝色箭头表示Fab片段，绿色箭头代表PT-刺突蛋白与Fab片段的复合体，红色箭头则指代交联的蛋白多聚体。详情参见图S6。 "Elution Volume"（洗脱体积）是指在色谱分离过程中，目标物质从色谱柱中被洗脱出来时所收集的溶剂总体积。
图S5 (D) 本部分描述了对scDb在增强隐蔽表位展示中的分子验证以及对抗体结合位点的详细分析。通过体外结合实验的尺寸排阻色谱结果来展示。实验中，分别将Fab片段和scDb与S1-S2切割位点突变的棘突蛋白孵育，这样做是为了减轻由IMCAS-364诱导的S1亚单位脱落现象。深蓝色箭头指示交联的蛋白多聚体，浅蓝色箭头代表棘突蛋白与Fab片段形成的复合体，绿色箭头则指单独的Fab片段。
然后，通过IMCAS-123 Fab-S复合物的冷冻电镜研究，我们深入了解了scDb如何介导隐蔽表位的暴露。我们观察到，70%的IMCAS-123 Fab-S复合物在上方的RBDs上有两个Fab，类似于人类ACE2（hACE2）结合期间的RBD开放构象（图2C和S6）。然而，如先前研究所述，这种RBD开放构象不足以使IMCAS-364自由访问RBD-8表位（图2D）。9,31因此，可以合理推测广泛RBD开放在观察到的协同效应中起着关键作用。我们假设RBD-5抗体的特定结合角度和位置可能促进scDb与相邻S蛋白的交联，从而诱导广泛的RBD开放（图2E）。
图2(C) 本部分介绍了使用冷冻电子显微镜(cryo-EM)技术解析的IMCAS-123 Fab片段与PT-刺突蛋白复合物的结构。该结构的 Protein Data Bank (PDB) 编号为8XSL。详情请参阅图S7。
图S6展示了IMCAS-123与PT-Spike蛋白复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）数据处理与验证流程，与图2C相关联。
(A) 为了结构解析，展示了用于准备IMCAS-123与PT-Spike复合物进行凝胶过滤的步骤。这一步骤有助于分离和纯化复合物，为后续的cryo-EM实验提供高质量样品。
(B) 展示了典型的二维分类图（2D classes）。二维分类是cryo-EM数据处理中的一个环节，通过这一过程可以初步分类粒子图像，剔除杂乱或不相关的图像，从而为后续三维重构提供清晰、一致的图像数据。
(C) 提供了图像处理流程图，概述了从原始图像采集到最终三维结构重建的整个数据分析步骤，包括图像校正、粒子挑选、二维分类、三维重构等关键步骤。
(D) 显示了分辨率估计的傅立叶壳相关（Fourier Shell Correlation, FSC）曲线。FSC曲线用于评估cryo-EM重建模型的分辨率，图中水平线标注了0.143的截止值。通常，当FSC曲线首次下降至0.143时所对应的分辨率被认为是该结构重建的黄金标准分辨率。这有助于科学家们判断最终获得的结构模型的精度和可靠性。
（通义千问加了很多话的）
探究协同效应依赖scDbs的机制
为了证实这种RBD开放机制的存在，我们着手解决RBD-scDb快速聚集的问题，这曾阻碍了我们的分析。我们最初使用SARS-CoV-1 RBD与123-316 scDb结合，随后在复合体中用SARS-CoV-2 PT-RBD替换前者。进行这一替换是因为IMCAS-316与PT-RBD的结合亲和力是与SARS-CoV-1 RBD结合的十倍。这一变化使我们能够得到更小且更便于分析的RBD-scDb复合物（图3A）。我们检查了由三个scDbs和三个RBDs组成的六聚体复合物，这些复合物约占所有颗粒的84.5%。六聚体复合物中RBDs的扭转角度超出了单个S蛋白内部形成交叉链接构型的容忍度（图3B和S7）。这意味着当scDb同时结合RBD-5和RBD-8时，scDb形成了额外的、较短的跨刺突交叉链接，进而可能对RBD施加张力，导致隐蔽表位的暴露（图2E）。
图3(A) 本部分描述了使用减速结合实验来展示123-316 scDb（一种单链双特异性抗体）与PT-RBD（预处理的受体结合域）之间相互作用的过程。
图3(B) 这一部分通过图示说明了由不同复合物产生的分子结构模式，并展示了这些复合物经冷冻电子显微镜分析所得的相应二维分类图像。具体展示了一种由PT-RBD与scDb相互作用形成的复杂六聚体结构。图中，红色虚线圆圈表示单一的scDb分子，其中红色端代表IMCAS-123，蓝色端代表IMCAS-316，二者共同构成了双特异性抗体的两端，而灰色部分则表示受体结合域(RBD)。这一结构的原子坐标已存入蛋白数据库(PDB)，其编号为8Y0Y。欲了解更详尽的结构信息及分析，请参考图S7。
图S7展示了123-316 scDb与PT-RBD复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）数据处理过程，与图3相关联。
(A) 展示了123-316 scDb与RBD复合物的代表性冷冻电镜显微图像及选定的二维分类平均图像。这些图像帮助研究者初步了解复合物的形态和分布，为后续的三维重构提供基础。
(B) 描述了分类、三维变异性分析和结构精炼的工作流程。这一流程是cryo-EM结构解析的关键步骤，旨在从大量原始粒子图像中筛选出高质量图像，进行精确分类，并通过迭代优化提高结构模型的分辨率。
(C) 提供了局部分辨率评估。这一部分分析了最终结构模型中不同区域的分辨率差异，这对于理解结构的精确度和可信度至关重要，特别是在复杂结构中不同区域细节清晰度的差异。
(D) 说明了使用“金标准”傅立叶壳相关（FSC，“gold-standard” FSC）曲线，并采用FSC=0.143的标准，确定了DmMon1-Ccz1-RMC1（这里似乎出现了笔误，应指123-316 scDb/PT-RBD复合物）的名义分辨率。FSC曲线是评估cryo-EM重构结构分辨率的常用方法，通过其首次降至0.143时对应的分辨率值来定义结构解析的极限。
(E) 本部分通过图示描绘了双特异性抗体在病毒表面介导的刺突蛋白交联模式。
为了验证更多具有短距离ABS的双特异性构建体产生类似的协同效应，我们创建了四种不同的123-316双特异性构建体。最初的构建体是123-316（15aa）scDb-Fc，其中scDb的刚性短连接子被灵活的(G4S)*3连接子取代。第二种构建体是123-316串联scFv-Fc，它保持了ABS间的短距离，但不是双体。第三种构建体是123-316 IgG(H)-scFv，其ABS间的距离比双体和IgG都长。最后建立的是一个标准的双特异性IgG，其中ABS与IgG的距离保持一致（图3C）。我们的结果显示，当奥密克戎部分逃逸IMCAS-123时，这种协同效应主要发生。两个具有短距离ABS的构建体保持了与具有刚性短连接子的123-316 scDb-Fc相同的协同特性。标准的双特异性IgG表现出部分协同效应。相反，长距离ABS构建体则完全失去了协同效应。
G4S，GGGSG的软性接头。
1.研究成果 合理距离串联4个官能团；2 2个原版直接勾兑；3 貌似是两头都有官能团 双重链的双抗；4 长距离串联作品 ；5 连接方式不一样的作品；6传统双抗，1个抗体2个不同的官能团
1.优化好的一个人双手都拿着大号双截棍 2.原版直接勾兑 3. 双头叉勺 就是西域春酸奶配的那养的 4.一个人双手拿大号双截棍技术原型 5. 一个人双手拿长链的大号双截棍 6. 传统意义双抗，一个人拿2根棍子。
(C) 下面是图形说明，用于阐明IMCAS-123与IMCAS-316双特异性抗体构建方式之间的区别，并附有一张表格，展示了针对特定奥密克戎(Omicron)变异株的一系列双特异抗体及其构型的假病毒中和效果指标。每个中和实验均进行了三次，每次有两个复制品（n=2）。计算了相对于对照组123-316 scDb-Fc的平均IC50值的倍数变化。
（应天雷教授的BN03也是展现出合理链接后的2个官能团，效果远优于勾兑使用的结果。就是小号双截棍）
扩大协同效应在多种抗体组合中的适用性
为了探索展现这种协同效应的抗体组合范围，我们将IMCAS-123与来自八个表位（RBD-1至RBD-8）的广谱抗体相结合。【17,31】由于IMCAS-123部分逃逸BA.4并完全丧失与XBB结合的能力，这一特点有助于我们观察协同效应的出现和消失。我们采用假病毒试验来评估协同效应，并将双特异性抗体活性与单个抗体及抗体组合使用进行比较（图4）。IgG样scDb-Fc格式下，RBD-5与RBD-2、RBD-7和RBD-8的组合显示了显著的协同效应（图4和S8A）。相应地，我们验证了RBD-8抗体与RBD-2、RBD-3、RBD-4、RBD-5和RBD-7的组合，证实只有RBD-5能够与RBD-8抗体产生协同效应（图S8B）。这一结果进一步证实了上述发现，即协同效应是由RBD-5推动的，其特定的RBD结合位置能够促进桥梁式相互作用，显著增强了与相关抗体的协同作用，挑战了先前仅聚焦于RBD-8的假设。
图4展示了不同表位抗体组合产生协同效应的关键决定因素。通过结合IMCAS-123与Hastie等人推荐的针对7+1个不同表位的抗体，形成了多种双特异性scDb-Fc结构。左侧的图示说明了这些组合方式，有助于理解IMCAS-123是如何与其他针对不同表位的抗体协同作用的。
中和曲线中的红色阴影区域象征着协同作用的程度。红色区域越大、越明显，表示曲线向左偏移得越多，这反映出在对抗假病毒中和实验中，协同效应更加显著和广泛。也就是说，抗体组合导致的IC50值降低，表明需要更低的抗体浓度就能达到同样的中和效果，体现了更好的协同作用。
每项中和实验均重复进行了三次，每次实验设置两个复制品（n=2），以确保结果的可靠性和重复性。中和曲线图示为三个独立实验的代表性数据。欲获得更详尽的实验数据和分析，参见图S8。
鉴于RBD-5抗体的相对保守性，我们认为BIOLS56（RBD-8）与IMCAS-L4.65（RBD-5）的组合为抵抗SARS-CoV-2提供了可靠的选择。【22】
利用协同效应开发治疗性抗体的可靠性
为了确定最佳构建方式，我们尝试了交换FV位置（56-65 V1）、用刚性连接子替换柔性连接子（56-65 V2），并建立了一个标准的双特异性IgG作为对照（图5A）。结果显示，56-65 V3（即Dia-19），与之前的研究一致，展现了最佳的中和活性（图5B）。在假病毒实验中，Dia-19对抗BA.2.86和JN.1的中和活性显著增加；与标准抗体组合使用相比，对抗BA.2.86和JN.1变异株的活性分别提高了200倍和160倍（图5C）。针对近期流行的XBB.1.5和EG.5.1毒株的真实病毒中和试验结果表明，其双特异性表现显著，IC50值分别达到4 ng/mL和7 ng/mL（图5D）。
图5（A）(A) 本部分通过图示说明了56-65组合的不同构建方式。构建方式包括三个版本：
V1（初始版本）：scDb-Fc 56-65的初始设计，未特别指出特殊的设计改良。
V2（优化版本）：基于V1的优化版本，关键改进在于将重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）之间的刚性连接肽替换为灵活的G4S（甘氨酸-丝氨酸）连接肽，这一改变可能旨在增加分子的柔韧性，从而改善其结合特性和生物活性。
V3（进一步改良版）：在V2基础上继续改造，主要变动在于scDb臂上56和65抗体片段的位置互换，这可能是为了优化抗原结合效率或改变空间布局，进而影响抗体的双特异性识别能力。
另外，提及了“规范双特异性IgG”的构建技术，采用了“knob-into-hole”（球-洞）设计方法来防止重链错配。具体来说：
针对65重链的改造：引入S354C和T366W突变，以形成所谓的“球”结构（heavy chain knob），这种设计能确保两个不同重链间的正确配对。
针对56重链的改造：包括Y349C、T366S、L368A和Y407V突变，以生成与之互补的“洞”结构（heavy chain hole），同时435R和436F突变用于阻止与蛋白A的非特异性结合。此外，提到了不同长度和序列的连接肽，包括：一个11个氨基酸残基的链接肽，序列RADSAAAGGPG；一个26个氨基酸残基的长链接肽，序列RADAAAAGGGGSGGGGSGGGGSGGGG；“Up hinge”（上铰链）序列DKTHTCPPC；以及G4S铰链，序列GGGGSDKTHTCPPC。这些不同的构建和设计旨在通过精准控制抗体的结构和灵活性，优化双特异性抗体的生物物理特性、稳定性和功能活性，从而提升其作为治疗性分子的潜力。
图5(B) 本部分对比分析了56-65抗体的三种scDb-Fc版本（V1、V2和V3）对抗假病毒的中和活性。图表中红色高亮部分表明，56-65 V3版本展现出最佳且最为均衡的中和效果，因此被命名为Dia-19。每一项中和实验都重复进行了三次，每次设有两个复制品（n=2）。报告的IC50值均为三个独立实验的平均数据。 可见V3效力显著最好
图5(C) 本部分对比了Dia-19（即先前命名的56-65 V3版本）与各自的父本单克隆抗体组合，在对抗当前流行的SARS-CoV-2变种所产生的假病毒时的中和效果。每一个中和实验同样重复实施了三次，每次实验设置两个平行样本（n=2）。所报告的IC50值为三个独立实验的平均结果。这一比较有助于评估Dia-19作为双特异性抗体在面对病毒变种多样性时的中和效率是否优于或等同于单克隆抗体的组合使用，为理解其治疗潜力和广谱性提供了重要信息。
(D) 本部分描述了使用真实存在的SARS-CoV-2变种进行的Dia-19与父本单克隆抗体组合的噬斑减少中和试验。结果显示为以毫克每毫升(mg/mL)为单位测定的IC50值。每次中和实验重复进行了两次，每次实验设置八个复制品（n=8）。报告的IC50值为两个独立实验的平均数据。
我们在K18-hACE2小鼠模型中评价了Dia-19对抗SARS-CoV-2 XBB感染的疗效（图5E）。在用10^4 TCID50的XBB病毒挑战后2小时，通过腹腔注射给予小鼠Dia-19（10、25、和50 mg/kg）。感染后第4天，与PBS对照组相比，通过腹腔注射10、25、和50 mg/kg剂量的Dia-19抗体治疗，显著降低了肺组织和鼻腔中病毒基因组RNA和亚基因组RNA的平均载量（图5E）。
图5(E) 这部分介绍的是在H11-K18-hACE2小鼠模型中使用Dia-19的治疗策略。通过实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）方法，利用针对ORF1ab区和E基因的引物及探针，分别测定了小鼠组织中基因组RNA（gRNA）和亚基因组RNA（sgRNA）的拷贝数。治疗给药途径分别为鼻内给药（i.n., intranasal）和腹腔注射（i.p., intraperitoneal）。
这些数据表明，Dia-19通过显著降低体内病毒载量，对抗SARS-CoV-2 XBB感染具有作为治疗剂的潜力。这一发现为双特异性体作为抗体药物开发中一种多功能工具的技术应用铺平了道路，为设计更有效的抗病毒疗法提供了见解。
讨论
单克隆抗体(mAbs)已被证明对抗SARS-CoV-2有效。1,27然而，SARS-CoV-2变异株的不断出现对其治疗潜力构成了挑战。【21,22,33】非RBM结合抗体因其能通过稳定RBD处于闭合构象或促进刺突间的交联以阻止ACE2结合来中和SARS-CoV-2，而日益受到关注。【8,34-36】其中，针对隐蔽表位的抗体作为一种非RBM抗体类型，最初被誉为“超级抗体”，尤其值得注意。这类抗体靶向位于S蛋白三聚体界面的隐蔽表位，这些表位在不同变异株中保持保守。但由于它们的暴露有限，导致中和活性受限。【9】我们之前关于RBD-8表位的工作发现，RBD-8和RBD-5抗体在scDb格式下的组合，而非在抗体组合使用中，能显著恢复对抗逃逸变异株的中和活性。【31】
本研究旨在确定维持这种偶然发现的协同效应的条件，从而为修改现有针对SARS-CoV-2及其变异株的抗体提供一种有前景的方法。利用基于双特异性噬菌体展示库来寻找和识别抗体，对于全面阐明这种协同效应的过程至关重要。双体中和实验表明，协同效应主要依赖于基于RBD-5的双体的结合特性。通过使用IMCAS-364抗体——该抗体虽能结合但不能中和奥密克戎变异株，我们理解了这种协同作用如何揭示隐蔽表位并加速S蛋白的交联。此外，IMCAS-123不能结合XBB，这一点对于帮助我们识别所有可能产生这种协同效应的抗体组合至关重要，并确认这种协同效应主要发生在RBD-5抗体遭受病毒逃逸的情况下。
双体的关键作用在于形成刺突间的交联，这种交联向外拉伸，进一步打开结合的RBD，允许更多的scDbs绑定到这个暴露的RBD-8表位，进而增强对SARS-CoV-2及其变异株的中和能力。这项研究不仅增进了我们对抗体间协同机制的理解，还为开发能够有效对抗快速进化的SARS-CoV-2及其逃逸变异株的治疗性抗体提供了新的策略和洞见。通过精心设计的双特异性抗体，如Dia-19，我们展示了如何通过精准定位和优化抗体的结合特性，克服当前治疗抗体面临的逃逸难题，为未来面对新发传染病时快速响应和有效治疗奠定了坚实的基础。
额外附加拓展文献
先行者
应天雷教授组的抗体官能团双截棍BN03 网页链接