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2019年9月24日/医麦客 eMedClub/--基因治疗是一种可以通过引入基因从而治疗疾病的临床技术，一种方法是使用腺相关病毒(AAV)作为传递基因的工具。AAV是一个多用途的病毒载体家族，拥有数百个自然存在的和实验室工程的衣壳，适合不同的基因治疗应用，是当今病毒介导的基因治疗最具吸引力的平台，也是研究基因功能和建立疾病模型极为重要的研究工具。
研究人员表示，当与现代基因编辑技术相结合时，AAV也是一种强大的研究工具，可以为建立转基因动物模型提供实用的选择。然而，广泛应用AAV的主要障碍仍然存在，如不切实际的纯化策略和低病毒产量，即生产大量的用于实验室动物的AAV的时间和成本高昂。
近日，波士顿大学医学院(BUSM)的研究人员第一次开发出一种先进的方案来生产大量的AAV，有望为基因治疗工具创造一种更快、更低成本的替代品。这种先进的技术采用无辅助（“helper-free”）作用的AAV系统，从HEK293T细胞裂解物和培养基中分离纯化AAVs。这在节省时间的同时，减少了用于研究的动物数量，最终降低了研究成本。
在病毒传递系统中，AAVs具有高基因转移效率、低免疫原性、稳定的长期表达和选择性组织趋向性，这使其成为相对安全的理想的基因治疗载体。它的产生需要细胞致病效应，即在存在辅助病毒诸如腺病毒、疱疹病毒等的条件下，才能复制产生子代病毒颗粒。而辅助性病毒很难清除，可能会在宿主体内引起炎症等不良反应。目前的AAV表达系统避免使用辅助病毒，而是用pHelper质粒替代，包括必要的基因，如E2A和E4。HEK-293细胞比较容易转染，是常用的表达研究外源基因的细胞株，这里采用HEK-293T细胞表达SV40 large T抗原，提供额外所需的蛋白。
这个AAV生产系统被称为“helper-free”，由三个不同的编码必要的病毒和辅助基因的质粒组成：
pHelper包含AAV复制(Rep)和衣壳(Cap)基因的AAV反式质粒以及编码目的基因、启动子和反向末端重复序列(ITRs)的AAV顺式质粒
对于之后的纯化，大多数方案建议从细胞的裂解物中纯化AAV，细胞在大型细胞堆或细胞培养工厂中生长，以获得足够的AAV用于动物实验。然而，细胞也会向培养基中释放大量的AAV，而这种培养基通常不会被使用。结合已报道的技术，研究人员优化了方案，以从细胞和培养基中有效获得AAV并纯化病毒颗粒。值得注意的是，这项研究实现了AAV产量的显著增加，同时所用HEK293T细胞数目比用于标准方案的正常数目少了5倍。此外，研究者还进行了碘黄醇（ iodixanol ）梯度纯化，使其制备纯度足以在体内使用。
▲ AAV净化流程图（图片来源：scientific reports）
研究人员用该纯化方案制备AAV2-DJ和 AAV2-DJ/8， 通过碘黄醇梯度纯化的AAV2-DJ/8具有良好的体内转化效果。AAVs已被用于在体内表达转基因，但在体外的应用很少。研究使用小鼠原发性肝细胞和骨骼肌来源的C2C12细胞，发现基于该提纯方案的AAV2-DJ能在体外有效感染细胞。总之，这种精细、快速、经济的AAVs生产纯化方案能在体内和体外高效地转化基因。碘黄醇的纯化有助于去除污染物，从而提高AAV纯度，减轻炎症，改善病毒在体内的转导。
BUSM医学助理教授、文章共同通讯作者Markus Bachschmid博士表示，“我们的方案有助于在常规实验室高效、经济地生产AAVs，这样研究人员就可以很容易地进行基因治疗的临床前试验。”
截至2018年11月13日，在ClinicalTrials.gov上有145项干预性临床试验中使用重组AAV载体。目前，几款重组AAV载体也已经获得批准在患者身上使用，它们是uniQure公司开发的Glybera（AAV1）和Spark Therapeutics公司开发的Luxturna（AAV2），以及诺华（Novartis）的基于AAV9病毒载体的基因疗法Zolgensma。Zolgensma于今年5月获FDA批准上市，用于治疗1型脊髓性肌肉萎缩症（SMA）患者，它是人类基因治疗的一个里程碑，显示了AAV的巨大潜力。
因此，众多科研实验室、生物制药公司都需要大量制备AAV，用于基础研究和早期临床开发。
结语
“在波士顿地区和日本的一些实验室已经测试了这个新方案，并发现它很有用，”BUSM医学助理教授、文章共同通讯作者松井玲子(Reiko Matsui)表示，“我们希望，更多实验室能够应用这些程序，以加快研究和促进基因治疗。”
载体的开发与生产对于基因治疗的研发与应用至关重要，我们期待这项改进方案能尽快被更多的应用并验证，为基因治疗的研发和临床应用提供最安全有效的帮助。
参考出处：
1.网页链接
2.DOI：10.1038/s41598-019-49624-w
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