Nature子刊:重大改进!上科大等研究团队开发新型AAV变体用于耳聋基因治疗,可安全高效...

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2019年8月20日/医麦客 eMedClub/--8月19日,权威期刊Nature Communications上在线发表了一篇论文,由上海科技大学钟桂生课题组、东南大学柴人杰课题组与复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李华伟课题组合作完成,该研究团队开发出一种新型AAV变体AAV-ie,可用于小鼠内耳中的基因递送。

其研究结果表明,AAV-ie能高效转导耳蜗支持细胞(SCs),代表了对传统AAV血清型的巨大改进。

耳聋基因治疗策略

听力丧失是最常见的感觉障碍之一,影响着世界6.8%的人口(约5亿人)。

目前治疗听力丧失的方法有助听器、振动声桥及人工耳蜗等。对于听力丧失超出助听器帮助的患者,唯一有效的治疗选择是人工耳蜗(CI)。CI是市场上最成功的感觉假肢装置。许多报告显示,大多数耳聋患者在接受CI后可以在安静的环境中理解言语。全世界大约有30万名患者接受了人工耳蜗植入,但这仅占所有耳聋患者的一小部分。CI也有很大的局限和弱点,例如频率敏感性、言语分辨及噪声环境下的感知困难。CI是假肢装置,需要患者在其一生中非常小心地使用。因此,听力丧失需要更好的治疗策略。

基因治疗已成为治疗听力丧失等遗传性疾病的潜在和有希望的策略。听力丧失作为基因治疗的潜在适应症,独特的优势:

耳蜗高度隔室化,并通过血液-耳蜗屏障(BCB)与身体的其他部分隔离,被认为是一种"免疫豁免器官"。这极大程度地减少了治疗所需剂量(研究成本低),以及药物渗漏到全身循环系统的风险,以减少不良免疫反应。

此外,耳蜗中的毛细胞和支持细胞通常不分裂,因此耳蜗中的细胞保持稳定,有望利用非整合型病毒载体(例如AAV)进行持续的转基因表达。

实际上,耳蜗中的毛细胞(HC)和支持细胞(SC)都有望作为基因治疗的靶标。其中HC分为外部HC(OHCs),其放大声音,和内部HC(IHC),其将声波转换为电信号。SC位于内部和外部HC之间,并将感觉上皮锚定到基底层,保护HC并维持其环境。

近一半的感觉神经性听力损失是由HCs和SCs基因突变引起的。一些关键耳聋基因主要在SCs中表达并具有功能,如GJB2,它影响SCs的间隙连接,是最常见的遗传性耳聋基因。

在哺乳动物中,非遗传性感觉神经性听力损失主要是由于噪音损伤、耳毒性药物或年龄引起的HC损失。虽然对HCs的损害在哺乳动物中被认为是永久性的,因为它们具有非常有限的HC再生能力,最近的研究表明SCs是有希望的内耳祖细胞,HC可以从中再生。因此,SCs是基因治疗的重要潜在靶标,不仅用于纠正遗传听觉缺陷,而且有望用于HC再生。

AAV作为基因递送载体存在挑战

虽然基因治疗已成为听力丧失等遗传性疾病的有希望的治疗方法,但它依赖于基因递送载体的鉴定。腺病毒相关病毒(AAV)载体介导的基因治疗已经被美国FDA被批准用于治疗罕见的遗传性眼病(AAV2)和脊髓性肌萎缩症(AAV9),但尚未鉴定出安全且有效的载体以靶向多种类型的内耳细胞。

几项研究已经在动物模型中测试了AAV介导的耳蜗基因疗法,结果很有希望;然而,大多数集中在HC和螺旋神经节神经元(SGNs)。一项研究使用了AAV1血清型将野生型GJB2递送到GJB2敲除小鼠的耳蜗SC中,但未能恢复小鼠的听力功能,可能是由于SCs中AAV1的低转导效率。

实际上,一些AAV血清型(包括AAV1)已经被评估用于耳蜗基因治疗,但遗憾的是,均显示在SC中的低转导率(0-13%)。因此,设计能够有效感染SC的新型AAV血清型是开发用于治疗遗传性听力损失的基因疗法的关键。

新型AAV载体——AAV-ie

以前的报道已经证明,通过圆窗膜(RWM)注射AAV载体可以成功地递送到内耳。使用这种方法,AAV需要穿过一个间皮细胞层来感染HCs和SCs。因此,具有跨间皮细胞层能力的新型AAV载体可以提高基因转移效率。

在最新发表在Nature Communications的这项研究中,研究人员开发了一种AAV变体AAV-inner ear (AAV-ie),用于小鼠内耳中的基因递送。

首先,为了获得AAV-ie,研究人员将三种不同的细胞穿透肽(CPPs)和一种类似CPPs的肽(DGTLAVPFK)插入到AAV-DJ的VP1衣壳中。AAV-DJ是一种合成血清型,与其他野生型血清型相比,在细胞系中具有更高的转导效率。

小鼠器官型外植体的离体转导表明,AAV-ie能感染近90%的SC。体内实验表明,在圆窗膜(RWM)将这些AAV注射入耳蜗后,AAV-ie转导SCs的效率明显高于其他AAV血清,代表了对传统AAV血清型的巨大改进。

AAV-ie高效感染耳蜗支持细胞(图片来源:Nature Communications

为了验证AAV-ie作为基因治疗载体的有效性,研究人员从一名成年患者身上采集了人类前庭上皮细胞,并对其进行了培养。经AAV-ie-mNeonGreen转导的SCs和HCs均显示出较强的mNeonGreen荧光,其中93%的SCs和76%的HCs可以被AAV-ie转导。这些数据表明,AAV-ie可能是临床治疗前庭功能障碍的有用载体。

作为治疗听力损失的基因递送工具,所使用的AAV应该对听觉系统的影响最小。小鼠研究表明,RWM注射AAV-ie是安全的,对HCs几乎没有或没有毒性作用,并且对听觉功能没有负面影响。

操纵信号通路和转录因子如基因Atoh1可促使SC转分化为HCs,为了评估AAV-ie载体对HC再生的潜力,该研究使用AAV-ie- Atoh1将小鼠Atoh1递送到耳蜗中。结果产生了许多新的HCs,表明了AAV-ie具有用于HC再生的潜力

结语

综上,该研究发现AAV-ie具有安全感染小鼠耳蜗HCs和SCs的能力,且具有较高的感染效率。研究人员表示,为了进一步证实AAV-ie可作为临床使用的基因递送载体,需要对成年大动物模型以及动物疾病模型进行研究。

考虑到部分耳聋基因主要影响SC功能,且SC具有再生HCs的能力,AAV-ie不仅在纠正遗传性听力损伤方面,而且在HC再生治疗环境和年龄引起的听力损失方面具有重要的潜力。

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