大规模临床级病毒载体生产过程,什么转染方法是最佳选择?

2019年6月15日/医麦客 eMedClub/--随着基因治疗产品的不断涌现,对符合临床用病毒载体的需求激增,推动了上下游工艺的优化。而制造病毒载体时要考虑几个因素,包括有效转导,靶向递送和受控基因表达。慢病毒与腺病毒载体在临床上使用最为常见,高滴度生产和大片段基因的整合能力以及静止/分裂细胞的高效转导都是这类病毒载体需要解决的问题。其中,最为关键的是病毒载体的转导方式,而瞬时转染方法只是一种临时解决方案,工业生产最终将需要建立大规模的转染方案。

转染技术是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术,它是研究基因表达调控,突变分析等的常规工具。随着功能研究的兴起,其应用越来越广泛。以下就向大家介绍一些转染的技术要点:

转染技术的分类

常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。

一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-96小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。

转染方法分为两大类,即生物方法和物理化学方法。物理化学方法中常用的有磷酸钙法、显微注射、电穿孔、脂质体介导的转染,以及最近出现的以高分子聚合物为载体的基因传递技术。生物方法则主要是以病毒作为载体,通过病毒感染的方式将外源DNA 导入到细胞中, 其中以逆转录病毒及腺病毒转染系统最为常用。

其中病毒载体的特点是整和效率高, 可使外源基因在宿主细胞中长期表达,缺点是存在潜在的安全危险性。

电穿孔法及显微注射法

电穿孔法及显微注射法的特点是转染率较高,缺点是需要昂贵的仪器,前者对细胞的损伤较大,后者在导入DNA 时需要一个细胞一个细胞地注射,不适合大量细胞研究的需要。

磷酸钙转染法

磷酸钙在良好的转染条件下,可以在293T等细胞的转染达到较高的转染效率。但磷酸钙转染有一个突出的问题,非常不稳定,尤其受pH值的影响非常大,在实验中使用的每种试剂都必须小心校准,保证质量,因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都可能导致磷酸钙转染的失败,经常即使最熟练的转染实验者也不能保证每次磷酸钙转染的成功,他们可能经常为莫名其妙的转染失败而沮丧。同时,他们还经常发现,往往小体积的转染比如6孔板以下的转染效果比较理想,可一换到大皿,经常转染效率下降很快。磷酸钙的先天缺陷往往是实验梗阻的主要原因。

▲市面上转染试剂对比(图片来源于网络)

脂质体转染法

已有众多的文献报道,脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调。如参与PKC(蛋白激酶C)通路调节;如抑制ATP酶的活性;如与线粒体膜发生作用;转染siRNA造成脱靶效应等等。细胞毒性的大小往往意味着对细胞生理活动影响的大小,脂质体这些作用是造成细胞毒性的根本原因。这会对相关研究数据产生严重的干扰,甚至影响研究的结论。这已引起了许多研究者的注意。

PEI转染法

人们一直在寻找更有效、毒性小同时对研究影响也小的转染试剂。由于脂质类转染试剂对细胞的毒性是由其脂质特性决定的,目前众多的研究者和生物公司将新一代转染试剂的开发聚焦在非脂质体的聚合物上,并已有一些优秀的试剂产品上市。

近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便,对 细胞毒性 小,转染效率高受到研究者们的青睐.其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂.聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子,使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子绵”(proton sponge)体.这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞,其效果好于脂质聚酰胺,经进一步的改性后,其转染性能好于树枝状聚合物,而且它的细胞毒性低.大量实验证明,PEI是非常有希望的基因治疗载体.目前在设计更复杂的基因载体时,PEI经常做为核心组成成分。

关于Polyplus-transfection

Polyplus-transfection SA是一家针对科学研究、生物制品生产以及治疗领域,从事研发和销售核酸转染创新型方法的生物科技公司。在全球范围内,Polyplus试剂被广泛应用到越来越多的临床试验中。除此之外,公司拥有大量的专利权和许可证书,包括治疗性siRNA转染的基本方法。

其中PEIpro® 产品系列是获得可靠的病毒载体生产和高感染滴度的首选转染方法,且从工艺开发到大规模临床级的病毒生产可直接放大和无缝过渡。在各种生产细胞中病毒产量最高。病毒载体的生产往往具有挑战性,特别是在大规模生产。病毒是通过细胞培养产生的,必须对宿主细胞系进行良好的鉴定,并对培养条件进行彻底的优化。细胞培养基和任何补充剂都需要具有临床级的质量。从监管的角度来看,应避免任何动物来源的原料,如血清和其他成分,因为这些可能含有不定因素。采用PEIpro® 转染是一种用于生产 AAV 和慢病毒(表 1)等治疗性病毒的有效方法。其他病毒类型的更多信息,如腺病毒、逆转录病毒和病毒样颗粒 (VLP) 等。

▲表 1. PEIpro®,高效且可重复的 AAV 与慢病毒等病毒载体生产的黄金标准。使用PEIpro® 生产 AAV 和慢病毒的最新文献和专利信息(图片来源:Polyplus-transfection官网)

PEIpro® 产品系列由三种质量等级的试剂组成:研发级的PEIpro®用于工艺开发,更高质量等级的PEIpro®-HQ用于临床前研究和早期临床试验,最高质量等级PEIpro®-GMP用于临床试验及商业化阶段。

▲不同质量等级的 PEIpro® 试剂满足核酸介导的每个阶段的病毒载体的生产(图片来源:Polyplus-transfection官网)

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