本月初，欧洲批准了首个CRSIRP人体试验。$CRISPR Therapeutics AG(CRSP)$ 和Vertex公司计划将在2018年下半年开展CTX001临床1/2期试验，用于治疗人类β地中海贫血。这家基因编辑公司自上市以来，终于在人们的翘首以盼中即将迎来第一例临床试验。CRISPR/Cas9这一新型基因编辑神器给基因治疗领域带来了更多的想象空间，也给“旧的”技术带了不小冲击。首当其冲的便是锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFNs）和TALENs技术。恰巧的是，作为ZFNs技术的代表公司——Sangamo也在今年2月份开始了一项基因编辑临床试验，针对的疾病正是β地中海贫血。另一方面，CRISPR公司也在向通用型CAR-T邻域迈进，除了$Sangamo Therapeutics, Inc.(SGMO)$ 公司以外，还直接挑战坐拥TALENs技术的$Cellectis S.A. - American Depositary Shares(CLLS)$ 公司。
β地中海贫血
存在于血液中的血红蛋白主要负责氧的运输。血红蛋白数量下降或功能缺失会引起贫血。正常血红蛋白由 4 个亚基构成, 最常见为成人血红蛋白 HbA（2个α亚基和2个 β 亚基构成，α2β2）, 这是成人血红蛋白的主要形式（占 98%以上）。另一种为胎儿血红蛋白 HbF （2个α亚基和2个γ亚基组成，α2γ2），这是胎儿发育期间及出生后血红蛋白的主要形式。刚出生时HbF可占全部血红蛋白 70%, 但随着年龄增长, γ 亚基表达开始减少, 而 β 亚基开始增多, 成年后HbF 含量一般不超过总血红蛋白的 1%（图1）。
图1. 胎儿出生后血红蛋白亚型的变化（图片引自CRISPR Therapeutics公司官网）
β地中海贫血患者由于编码β亚基的基因出现突变，从而导致患者体内β亚基合成不足，进而导致小细胞低色素贫血，严重的患者需要长期依赖输血才能维持生命。据估计，每年约新增6万名β地中海贫血患儿，每名患者将带来近100万美元的经济负担。
近年来研究发现，BCL11A是调节HbA和HbF的关键基因。在胎儿出生后，BCL11A基因直接抑制HbF的表达。对此，研究人员通过抑制BCL11A基因，从而使HbF在成人中重新表达。研究显示，通过增加β地中海贫血患者中HbF的表达，就能够取到保护作用（图2）。除了技术平台不同，Sangamo和CRISPR公司使用的是相同的治疗策略。严格意义上说，两家公司的治疗策略都没有直接纠正缺陷的β 亚基基因，而是通过敲除BCL11A基因的增强子区域，抑制BCL11A基因的表达，从而上调HbF。在具体操作时，先是从患者身上提取造血干细胞，然后用CRISPR 或者ZFNs干扰BCL11A，最后将编辑后的造血干细胞回输到患者体内（图3）。
图2. HbF减少β地中海贫血患者症状（图片引自CRISPR Therapeutics公司官网）
图3. β地中海贫血基因编辑资料策略（图片引自Sangamo Therapeutics公司官网）
CRISPR公司临床前数据（CTX001）显示，使用CRISPR敲除BCL11A的效率可达约80%，敲除BCL11A后HbF比例显著增高，γ和β亚基与α亚基的mRNA比例上升至无症状携带者水平。（图4、5）
图4.（图片引自CRISPR Therapeutics公司官网）
图5.（图片引自CRISPR Therapeutics公司官网）
Sangamo公司在去年的美国血液协会年会上（ASH）也公布了部分临床前（ST-400）数据，BCL11A的打靶效率也约为80%，其中>50%的细胞成功敲除两个BCL11A位点，和对照相比，γ亚基表达量上调4倍。总体来说，两家公司编辑效率相当。Sangamo公司的临床1/2期试验目前已开展入组（网页链接），在速度上略微领先。另外，这两家公司还都同时在另外一种遗传学血液病——镰状细胞贫血上有所动作。镰状细胞贫血是另外一种β亚基突变，同样的治疗策略（提高HbF）也适用于该疾病。
通用型CAR-T
关于通用型CAR-T，我在之前的文章也有过介绍（详见：通用型CAR-T细胞免疫疗法的前景展望），目前处于领跑地位的依旧是法国的Cellectis公司，其背靠辉瑞和Allogene公司，目前已有两项产品处于临床试验阶段。除了UCART19授权给Allogene以外，去年被FDA中止的UCART123项目也在修订试验流程后重新进行病人入组。
Sangamo公司也在本月举行的美国基因与细胞治疗学会（ASGCT）也更新了通用型CAR-T项目，TRAC和β2M双重敲除效率为91%，在双重敲除的同时插入CAR的效率为77%（图6）。公司还尝试了三重敲除加一个插入的组合，在敲除TRAC和β2M的同时还敲除了免疫检查点基因CISH，并在TRAC位点插入GFP。实验结果显示，有76%的细胞同时实现了这4个编辑（图7）。目前Sangamo Therapeutics公司测试的靶点只有CD19。
图6. 双重敲除的同时插入CAR（图片引自Sangamo Therapeutics公司官网）
图7. 三重敲除加一个插入（图片引自Sangamo Therapeutics公司官网）
CRISPR公司在通用型CAR-T的发展则显得十分迅速。公司之前已经完成了CD19通用型CAR-T （CTX101）的生产，亟待在今年第四季度提交IND。公司在4月份举行的美国癌症研究协会（AACR）年度会议上还更新了两外两个靶点数据（详见：CRSP：公司项目进展）。其中使用靶向B细胞成熟抗原（BCMA）的通用型CAR-T细胞将被用以治疗多发性骨髓瘤，而针对CD70的通用型CAR-T细胞则希望能够在实体瘤中取得进展。与此同时，公司利用CRISPR/Cas9简易高效的特点，在多重编辑上完出了花样，在本月的ASGCT会议上，公司展示了TCR-/β2M-/PD1-/Edit4/CAR+这一五重编辑组合，编辑效率达到60%（注：Edit4为第四项编辑，具体基因公司没有透露）（图8）。能够快速对多个位点进行同时编辑，这也为CAR-T疗法提供了新的思路和空间。
图8. 五重编辑（图片引自CRISPR Therapeutics公司官网）
结语
人事有代谢，往来成古今。生物技术的迅猛发展让这个行业显得如此残忍。这些“旧”的编辑技术其实也刚步入临床试验阶段。可在CRISPR横空出世之后资本的天平便慢慢往CRISPR技术倾斜了。抛开其它因素，如果只是针对β地中海贫血或CD19通用型CAR-T，这几种编辑技术的效率是旗鼓相当的，像TALENs甚至具有更好的安全性。当然，Cellectis公司依旧是通用型CAR-T的领跑者，而Sangamo公司目前的核心项目还是基于AAV病毒的基因治疗，包括血友病和粘多糖增多症。突然想到铁扇公主的那句台词：“以前陪我看月亮的时候，叫人家小甜甜，现在新人胜旧人了，叫人家牛夫人！”是的，CRISPR现在正是别人眼中的小甜甜。
参考资料
Nat Genet. 2018 Apr;50(4):498-503. doi: 10.1038/s41588-018-0085-0. Epub 2018 Apr 2. Natural regulatory mutations elevate the fetal globin gene via disruption of BCL11A or ZBTB7A binding.
CRISPR Therapeutics公司官网
Sangamo Therapeutics公司官网
Cellectis公司官网