叩响CRISPR基因编辑治疗之门

十年前的那个六月,对于整个生物技术领域而言,都是一个值得铭记的特殊时刻。

正是在2012年6月28日,Science发表了《A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity》网页链接,正式拉开了CRISPR-Cas9这把倚天之剑的传奇序幕。

十年弹指一挥间,CRISPR无疑成为人类生物技术发展史上,进展最为迅猛的新兴技术之一,Nature Biotechnology在6月7日发表了一篇简短的Review《Knock-in on CRISPR's door》,捋了一下CRISPR技术在治疗领域的进展和挑战,以较高的视角俯瞰来路和展望前途。

从2016年以来,目前在clinicaltrial.gov上有近60项临床登机,其中绝大部分是体外CRISPR编辑细胞再输注到体内发挥功能,例如各类CAR-T治疗肿瘤和造血干细胞治疗血液疾病等,而体内编辑还非常少见。顺便感叹,国内的快(ceng)速(re)跟(dian)进堪称身手敏捷,这里超过一半都是中国研究者,包括卢铀教授发表的鼎鼎大名的全球首个CRISPR基因编辑T细胞临床数据网页链接

CRISPR-Cas9在十年来指数级扩展的研究应用中,被证明是比ZFN和TALEN等更优越的基因编辑工具,通过能够准确靶向位点的sgRNA,Cas9核酸内切酶在基因组上形成双链断裂(DSB),这个断裂切口会被细胞内生机制所修复。在没有DNA供体模板的情况下,通过相对更高效的非同源末端连接(NHEJ)机制,可以在靶向位点形成随机的碱基插入和缺失(Indels),导致目标基因失活;在有DNA供体模板的情况下,在细胞分裂周期、通过效率较低的同源重组(HDR),在靶向位点准确敲入一段序列。网页链接

在DSB修复过程中,NHEJ和HDR可能会形成很多种产物,从而在靶向位点和脱靶位点都有可能产生一系列不可预测的Indels,包括染色体异位和大片段缺失等。这引起对基因毒性的隐忧,也成为了CRISPR工具的阿喀琉斯之踵。此外,p53基因被证实会抑制CRISPR-Cas9产生DSB后的编辑效率,因而被成功编辑的细胞会变相形成对p53抑瘤基因突变的选择性富集,从而导致编辑后的致癌风险。网页链接

由CRISPR-Cas9基因编辑过程的DSB等而带来的各类安全性隐患,包括但不限于脱靶Indels、染色体大片段缺失、p53等突变选择性富集、破坏DNA-PK依赖的修复通路引发基因损伤等,虽然经过了众多研究者大量的优化工作,但无疑这短短数年时间远不足以得到有效的控制和验证

因而FDA也对基因编辑疗法给出了最为严格的,今年3月发布的《Human Gene Therapy Products Incorporating Human Genome Editing》,其中直接建议对接受基因编辑的受试者应长期随访至少15年网页链接

今年即将进入临床阶段的单碱基编辑器(Base Editor)系统,就回避了DSB且不需要DNA供体模板,它通过sgRNA引导Cas9切口酶到一段3-5bp的、包含靶向DNA碱基的编辑窗口,通过脱氨酶作用替换成另一个碱基,腺嘌呤碱基编辑器(ABE)和胞嘧啶碱基编辑器(CBE)分别能够将A/T和G/C相互转换。单碱基编辑器不仅在细胞的分裂期和分裂间期都可以发挥作用,而且产生Indels的概率较低(在增加尿嘧啶糖基化酶抑制剂后编辑效率倍增)。网页链接

此后,又开发出了C/G之间的互换编辑器(CGBE),补上了嘌呤和嘧啶之间的转换(ABE和CBE都只是嘌呤和嘧啶内部的转换),虽然编辑效率还相对低,而且A/T之间还没有互换编辑器。网页链接

原本单碱基编辑器的最大优势就在于不引入DSB、而有可能减少Indels,然而研究发现,一方面在5bp编辑窗口内可能存在不止一个C、从而可能出现脱靶编辑(bystander),另一方面脱氨酶对DNA和RNA都有活性、从而可能在编辑DNA的同时也编辑RNA,这些都一度导致对单碱基编辑器的脱靶毒性产生较大的担忧

网页链接

网页链接

好在后续又在编辑器上打了各种补丁,降低对DNA和RNA的脱靶毒性网页链接

单碱基编辑器的两家明星企业Beam和Verve,分别是27亿美元和7亿美元市值。前者的BEAM-101采取在体外编辑造血干细胞方式来治疗SCD和β地贫,后者的VERVE-101则更加积极的用LNP递送ABE在体内编辑PCSK9基因。

单碱基编辑器毕竟只能实现少数几种碱基转换,而下一种有希望冲击临床阶段的基因编辑技术是先导编辑器(Prime Editor),同样可以在不引入DSB和DNA供体模板的情况下,在靶向位点实现插入、缺失、以及A/T/C/G碱基之间所有12种转换。它是一种“搜索和替换”(Search-and-replace)的策略,由一条改造后的向导RNA(pegRNA)来引导,再由Cas9切口酶和逆转录酶融合来实现编辑。

pegRNA在sgRNA基础上,3’端有一段引物结合序列(PBS)和转录模板序列(RT Template),既是引导、又是模板,在它的引导下,Cas9切口酶切割DNA单链,PBS识别断点前的互补序列(PAM),逆转录酶以RT Template为模板进行逆转录,将目标序列直接聚合到切口的DNA链上。网页链接

先导编辑器的优化还在进行之中,包括增强逆转录酶活性、在非编辑链上引入新切口、将切割非编辑链的gRNA引导至编辑链上靠后的序列等,以图提高编辑效率、降低DSB和Indels。网页链接

目前Prime Editor已经在动物体内作出了不错的数据,但在体内对编辑器和载体产生的免疫反应,仍是未来向临床迈进过程中需要克服的门槛。网页链接

还有一些更早期的脑洞,例如试图通过RNA引导的整合酶或转座酶,来插入10kbp以上的大片段,但目前都还有不少明确的问题尚待解决。

网页链接

网页链接

以上各种编辑策略的迭代基本都是围绕减少脱靶这个目的进行,而另一个更棘手的问题是递送。当然在体外编辑之后的细胞再回输可以作为权宜之计,但基因编辑的星辰大海终究还是需要在体内编辑来实现,所以不克服递送,基本上CRISPR就仍困于笼中。

AAV和LNP依然是目前看起来最有谱的递送选择,都不乏拥趸,前者的代表是Editas(EDIT-101)、后者的代表是Intellia(NTLA-2001)。然而,AAV的搭载能力受限(4.7kb)、且自身的脱靶风险和免疫原性都还没太洗干净,LNP看上去解决了一部分局限性、但递送效率仍有待提高。网页链接

在CRISPR并不太长的发展历程中,我们不难注意到一个远不同于此前其他主要技术路径的特征:由于该技术从诞生伊始就得到极其广泛的应用,发展路径呈高度发散和齐头并进之势,试错和迭代速度明显提高

想想小分子,20世纪初就有了最早的化药砷凡纳明,到1960年代才进展到明确的受体抑制剂普萘洛尔,再到1990年代在蛋白晶体学进步后才能基于受体结构设计药物有了沙奎那韦,最后到21世纪初有了首个激酶抑制剂伊马替尼;再想想抗体,1970年代杂交瘤技术出现,1980年代鼠源抗体上市,1997年首个人鼠嵌合抗体美罗华上市,1998年首批人源化抗体赫赛汀/Synagis等就上市,2002年首个全人源抗体修美乐上市,很快ADC/双抗/纳米抗体等迭代都陆续出现。然而CRISPR的速度是,最早的CRISPR-Cas9基因编辑治疗产品刚进入临床,有望规避已有编辑策略风险的新编辑器就已经层出不穷,技术演进的提速肉眼可见

诚然,一种新兴技术从实验室和文献走向临床应用,几乎必然要经历各种各样最初未曾设想的问题,甚至可能南辕北辙。这个过程中就势必伴随着研究者、创业者、投资者的失利和痛苦,恰好这十年又同时是Biotech行业加速资本化的周期,一批初创企业离临床很远却离资本很近,使得技术发展过程中的风吹草动都在资本市场上得到放大

虽然眼下整个CRISPR的各条路径似乎都还有不少障碍和顾虑,甚至我个人认为完全可能出现大的波折和反复,然而伸手的人多了、叩门声已经愈来愈响,基因编辑这扇大门必将敞开。

$CRISPR Therapeutics(CRSP)$ $Beam Therapeutics(BEAM)$ $Crispr与基因编辑技术(XDNA)$ 

雪球转发:11回复:15喜欢:39

精彩评论

全部评论

稷下小鱼06-22 14:36

梳理的很好。确实生命科学技术迭代很快。就rnai递送来说,不光有AAV、LNP、PNP、GalNAc等技术,现在也有公司在研发无递送核酸技术。而且,不光技术本身迭代快,技术的应用拓展也是以前所不能比拟的。比如,CRISPR在检测方面就比PCR有许多优势,是未来的市场应用拓展方向之一。

雨山居士06-22 13:58

三键三连

空之客06-22 13:31

伦理也不区分好不好的,大家都认可一套就行。我指的“伦理”是说创业者的付出程度,国内由于很多规矩尚未建立和博弈平衡尚未达成,投资人对于创业者事实上并无有效制约,因而普遍要求创业者全身心投入、甚至不应该有退路,更不应该脚踩很多条船;但这种要求在美国并不存在。

作手没有假期06-22 13:15

我怎么感觉国外的伦理更好一些,国外新业务基本都在体内孵化,国内随便就能拆个三四家子公司单独上市

空之客06-22 12:54

咱不能拿国内创业的环境和伦理来要求对岸,美东和硅谷的这些学术大佬,一个人作为十几家公司的scientific founder也是寻常,管生不管养对他们来说并不算什么问题