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基因疗法，即通过改变病人的某些细胞的DNA序列来缓解症状的治疗手段，已经发展了近三十年。令人惊讶的是，第一个获FDA批准的基因疗法居然早在1990年。在那个年代，希望借助逆转录病毒感染细胞的过程，将正常的基因片段插入基因缺失的病人染色体中，从而根治由于基因缺失而导致的遗传病的理念就已被视为未来疾病防治的重要发展方向。但从理论走向临床的道路是艰难而持久的。过去三十年来，基因疗法在安全性和有效性上都受到了极大的挑战。许多临床实验或是失败或是因为安全隐患被迫停止。安全性方面，医学上最顾虑的问题在于逆转录病毒在染色体插入位点的不确定性而有概率导致致癌基因的激活。2002年的针对基因疗法治疗腺苷脱氨酶缺乏症（ADA deficiency）的临床实验中，十位参与实验的儿童居然有两位都引发了白血病类似症状，不得不让FDA紧急叫停了实验。几个月前针对CRSPR非特异性位点插入的忧虑也恰恰说明了医学界对于基因疗法安全性的零容忍程度。而有效性方面，蛋白表达的水平和免疫系统对于重组细胞，重组蛋白质的普遍攻击也使得不少基因疗法没有得到预期的持续效果。目前，各种基因疗法在安全性和有效性这两个方面都面临着巨大挑战。
今天狼哥主要介绍的AAV(Adeno-associated virus腺相关病毒)基因疗法，是一种90年代开始发展起来的基因疗法。腺相关病毒是一种很特殊的病毒，它结构简单，基本不引起疾病，能感染分裂和不分裂的细胞。而经过改造后的rAAV (recombinant AAV 重组腺相关病毒),由于在病毒基因组里敲除了rep和cap基因并且插入了病人缺失的正常目标基因，rAAV不能自我复制增殖，病毒基因组也不能插入人染色体中（基本不能，但临床实验还是发现了1%以下的染色体整合率），而是感染后以游离态环状DNA分子的形式把目标基因保存于细胞核中。所以相比逆转录病毒疗法，rAAV疗法更安全可控。当然，劣势是逆转录病毒把目标基因插入人细胞染色体后，该目标基因会随着人细胞分裂而复制到所有子细胞中。但游离态环状DNA不能在细胞分裂的时候复制，所以会随着细胞不断分裂，死亡，数量越来越少。
目前，全球大约有两百多个AAV疗法相关的临床实验，大部分都临床在I至II期，是排名第四流行的基因疗法（见下图）。AAV基因疗法的大部分临床实验主要针对眼部遗传疾病，血友病A/B（患者血液内缺少Factor VIII/Factor IX），神经系统疾病和肌肉组织遗传病。除了AAV质粒携带DNA(小于5kb)等的限制外,造成这种临床局限性的主要原因，也是狼哥认为现在AAV基因疗法最大的挑战，就是治疗中碰到的人体免疫反应。事实上，由于大约有70%的人口在出生三年内都会被自然界中的AAV感染过，在人体免疫系统里面有了针对该病毒的记忆，所以在循环系统里会有少量的中和抗体（Neutralizing Antibody）。在rAAV经过注射入病人的血液或者目标器官后，中和抗体会首先结合一部分的rAAV使其失活。而病毒颗粒表面的包裹蛋白或是直接或是通过受感染细胞的MHC分子呈递到细胞表面间接的唤醒免疫系统的记忆，从而使T细胞攻击rAAV或者受感染的重组细胞而影响疗效。
然而，人体的眼球和神经系统是免疫特权组织。可能是由于眼球细胞和神经细胞比较弱的再生性和修复性，进化决定了眼球和神经系统内环境中免疫反应比较弱，淋巴细胞不易浸润。所以，把rAAV直接注射到眼球或者神经系统内，引起免疫系统的攻击比较少，疗效可以持续。FDA在2017年12月批准的美国史上第一个AAV药物就是Spark针对罕见遗传性眼病的药物Voretigene Neparvovac (Luxturna)。而刚刚诺华花87亿美金收购的Avexis，其开发的治疗脊髓性肌肉萎缩症(SMA)的AAV疗法也是将rAAV感染运动型神经元，从而回避了免疫反应。概括来说，AAV疗法在免疫特权组织里获得了不错的成功。
而另一方面，血友病和肌肉组织的AAV临床实验主要是因为，血友病A/B对应缺乏的凝血因子VIII，IX主要在肝脏合成。而肝脏和肌肉细胞分裂周期缓慢，所以医学研究人员认为rAAV转入的目标基因可以在组织细胞里存在比较长的时间。有临床数据表明，在经过rAAV转染的肝脏和肌肉细胞在七年后还能在人体内继续表达目标蛋白(Nathwani,2011)。但是，在不少临床案例中，有病人经过转染的肝脏和肌肉细胞因为呈现了目标蛋白和病毒cap蛋白等异源物质，在转染几周到数月后引起了免疫系统的攻击。比如在一些血友病B型临床实验中，患者输入携带Factor IX基因的rAAV后体内产生了Factor IX蛋白，说明基因转入成功。但在数周的时间后，发现病人肝脏转氨酶突然的升高和Factor IX浓度的迅速降低。研究发现这些病人的肝脏细胞受到了自身T细胞的攻击，成功转染Factor IX基因的重组肝脏细胞被大量杀死(Mingozzi, 2013)。医生通过在免疫窗口期服用大剂量可的松等激素来抑制免疫系统反应可以保留部分重组肝脏细胞，但临床实验数据反映这些病人在服用激素后，目标蛋白的表达最终只能达到正常水平的2~4%，远没达到临床无症状所需的20%以上的水平。
所以，注射入体内的rAAV和成功转入目标基因的人体细胞如何避开自身免疫系统的攻击，是AAV基因疗法在肝脏，肌肉细胞上运用发展的要点。众多医药开发者目前采用的手段有：1，选择血液中基本不含有中和性抗体的病人。2，选择合适的AAV菌株（比如猴源的AAV8）或改造rAAV的衣壳结构，降低衣壳（capsid）蛋白引起免疫反应的强度。3，控制rAAV注射计量。4，实时监控免疫系统的活动，必要时给与大剂量可的松等激素来抑制免疫活动。5，运用空包AAV,即不含有DNA物质的病毒衣壳来中和血液中的抗体。6，利用血管气球导管把药物直接运送到目标器官，减小rAAV在血液中的暴露时间。7，目标蛋白可能被识别为异源物而受到免疫系统的攻击，其（可能的）机理是细胞内目标蛋白表面暴露的酪氨酸经过磷酸化和泛素化(ubiquitination)后,被蛋白酶分解成小片段。小片段会通过主要组织性相容复合体(MHC)呈递到细胞表面供T细胞识别。所以如果把目标蛋白暴露在表面的酪氨酸替换成其他氨基酸，则可以减少被降解和引起下游免疫反应的概率。
狼哥认为，这些手段并没有很有效的解决人体免疫针对重组肝脏细胞攻击的问题。逐条来看，第一条，只有不到30%的病人满足不含有中和性抗体这个条件，适用人群一下子小了很多，何况很多AAV针对的疾病本身就是罕见病。第二条，改变衣壳蛋白结构但同时保证细胞转染效率，难度不小。第三条，临床实验发现，因为rAAV转染效率肝脏不高，如果注射浓度太小，那能够产生重组蛋白的细胞数量不够，不能完全恢复正常的生理功能。但如果注射浓度太大，马上会引起免疫反应，也会影响感染质量。所以需要非常合适的浓度。鉴于每个病人具体情况不一样，合适的rAAV浓度范围也不一样。这种不确定的用药计量将难以避免的导致某些病例或是浓度不够或者浓度太高而影响疗效。第四条，免疫活动的监控对于病人来说不太方便，成本高。而免疫系统的抑制和大剂量激素的副作用也是显而易见的。第五条，和第三条一样，空包病毒浓度低了起不到预期的效果，浓度高了又会引起免疫反应。第六条，增加了实施的难度，而效果提升有限。目前的临床实验主要通过静脉注射，方便易行。如果运用气球导管，整个手术的风险和成本都极大的提升。第七条，经过酪氨酸替换的目标蛋白有可能分子结构有所不同，生物活性需要检验。
那么，Spark的治疗血友病B型的AAV药物SPK-9001又有什么样的特点呢？狼哥发现，Spark还是花了不少努力来改进rAAV的效果的。比如Spark在Factor IX上面设计了一个单氨基酸突变，使得这得改进的Factor IX的催化活性提高了八倍。Spark也利用了AAV8, 最大的降低了rAAV受中和性抗体的影响。而且，今年年中的实验结果表明，平均来看接受rAAV注射的病人平均恢复了大约正常人30%的Factor IX活性。表面上看起来，SPK-9001的疗效还不错。但是，SPK-9001的限制还是非常多。首先，它的临床实验还是排除了体内有较高中和抗体的病人。其次，根据五月份的结果显示，15个临床实验参与者中，6个病人在接受了rAAV注射后，还是由于不同的原因接受了后续Factor IX的注射，这不是个好现象，表明了Factor IX在肝脏细胞中表达的个体差异较大而且不稳定。15位病人中还有两个病人在治疗过程中发现免疫细胞攻击自身肝脏细胞，所以在短时间内使用了可的松来抑制自身免疫攻击。受免疫系统攻击后重组细胞的数量大大减少，影响了Factor IX的表达量。但更重要的问题是，免疫系统对转染细胞的攻击或者随着转染细胞分裂，而导致目标基因表达量的衰减是个不可逆的过程。因为rAAV的第一次注射会让免疫细胞获得记忆，决定了后续注射是基本无效的。比较无奈的是，SPK-9001长达五年的临床I/II期实验，现在才过去了两年的时间。在接下来的三年中，数据只会变差，而且基本无法通过后续补偿手段而改善。最后，Spark其实在之前还有一个一期血友病B型的临床实验药物AAV8-hFIX19，不过后来在未公布原因的情况下中止，也说明了Spark其实已经意识到该疗法还有很多不成熟的地方。所以，去年年底SPK-9001以初始现金10M，后续最高额外25M奖励和两位数百分比(估计约20%)的销售分成的价格把该药转让给Pfizer来开发三期临床。该价格也比2014年最初签署的合约(初始20M现金，后续最高260M奖励)低了很多。这也说明了市场对于该管线的估值也已大大下降。
Spark的A型血友病管线，采用的原理和B型类似，难度还略大，因为Factor VIII分子更大，转染效率更低。最主要的问题是，Spark也没有通过一些根本上的方法来解决自身免疫系统对自身重组肝脏细胞的攻击，所以狼哥预计实验结果并不会比B型的管线来的好。
当然，狼哥认为，介于肝脏强大的恢复能力，rAAV血友病临床实验的安全性隐患不大。即使发现转氨酶的升高，在病人日常的生活中也没有显著的症状。而且，rAAV染色体整合的概率不大，环状游离DNA是比较安全的转基因形式，所以rAAV药物的安全性应该是没有问题的。
估值来看，目前，Spark的管线中，已经获批的治疗罕见眼疾的药物Luxturna由于在全美只有不到2000个病人，未来十年的销售已经被福布斯的医药板块专家Matthew Herper无情的看贬(Herper, 2018)。根据Matthew的估计，未来十年Spark总共也只能卖600M，狼哥觉得这已经是一个比较理想的数字了。Spark把在北美之外的销售权转让给了诺华，会拿到20%的销售分成，所以预计未来十年全球总销售额约为750M，按照目前10% WACC来计算该管线价值也就470M左右。其他有关眼疾的管线都比较早期，可以打包成100M来算。
Spark在有关肝脏的管线中，有数个针对血友病A/B型的AAV药物。全美大约有两万血友病A/B型病人，其中B型约4000人。鉴于北美有关B型的临床实验有Sangamo, Dimension, uniQure等公司激烈的竞争，虽然Spark/Pfizer率先进入三期临床实验，但能有25%的渗透率就已经非常理想了。由于AAV疗法只需要一次注射，收费可能高达数百万美元。假设三期百分百成功率，每个病人两百万美元费用计算，未来一共能给Pfizer带来2B的销售额，那么Spark可以得到400M的总收入，对应的NPV为200M左右。A型血友病在AAV疗法上也有Biomarin，Sangamo等竞争对手，而且Biomarin已经率先进入三期，应该会在该领域落后于对手。假设一期药物25%的成功率，四到五年的上市时间，25%渗透率，对应的NPV也在1B以下。
其他神经系统的药物，主要都还在临床前，就暂时不计入市值之内。综上，狼哥计算的Spark市值约为1.7亿美金。其实和现在的市值非常的接近。那狼哥为什么还要把它作为做空的目标呢？其实，从今年七月Spark在股价的最高点92块以来，短短四个月内已经腰斩。所以估值的泡沫已经被基本挤压干净了。狼哥不是觉得Spark估值高，而是基于对现有临床数据的了解和判断，而对非眼部和神经系统的器官，在自身免疫系统作用下是否存在稳定，长期而有效的AAV基因疗法信心不足。AAV终究是外源异物，免疫系统的作用机理又非常的复杂，人类才窥探了一个皮毛，基因疗法要想过这一关没那么容易。另外，别的基因疗法，比如CRSPER等技术发展迅速，也对AAV直接产生了威胁。
基因疗法炒完概念后，医学工作者开始返璞归真。本着缺啥补啥最简单的原理，Roche的人工合成Factor VIII类似物等简单粗暴的药物Heaven 3也进入了三期临床。虽然注射频率较高 (2周一次，未来可以改进到一个月一次),但完全没有基因疗法这样那样的幺蛾子，简单可靠。未来药物注射的便利，也让基因疗法治疗血友病的前景蒙上了阴影。基于以上，狼哥认为ONCE还是一个不错的做空对象。
特别声明：该文纯属作者个人观点，不代表市场未来走势，股市有风险，生物医药板块波动性尤其大，请读者个人判断后再做投资决策
参考文献
Nathwani, A.C., Tuddenham, E.G., Rangarajan, S., Rosales, C., McIntosh, J., Linch, D.C., Chowdary, P., Riddell, A., Pie, A.J., Harrington, C., et al. (2011). Adenovirusassociated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. N. Engl. J.Med. 365, 2357–2365.
Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 2013;122(1):23–36. doi:10.1182/blood-2013-01-306647.
Matthew Herper, Jan12, 2018, 网页链接