2024年4月26日
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脑转移（BM）是晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者癌症相关死亡的主要原因之一。然而，由于血脑屏障（BBB）的存在，可用的治疗方法有限。外泌体已被证明是一种具有低免疫原性和高相容性的天然载体，使其成为运输癌症治疗试剂的理想工具。J Nanobiotechnology于2024年4月8日发表了一篇文章：Anti-EGFR ScFv functionalized Exosomes delivering LPCAT1 specific siRNAs for inhibition of lung cancer brain metastases。在这项研究中设计了一种由scFv和外泌体表面蛋白 lamp2b 组成的融合蛋白，该融合蛋白在来源于HEK293细胞的外泌体表面表达，以实现细胞靶向和治疗功能；用LPCAT1 siRNA（siLPCAT1）包封携带EGFR的工程外泌体，工程化外泌体显示出高颅内通透性和对脑肿瘤的递送效率，在癌症转移性脑肿瘤中发挥了强大的抗肿瘤作用。
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在基因表达综合库（GEO）中进行了搜索，并最终纳入了一个队列（GSE131907，Ahn M等人），其中包含来自44名患者的58个组织样本的scRNA-seq数据，包括11个正常肺组织、11个原发肿瘤组织、10个脑转移和其他组织。
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6周龄的雄性BALB/C裸鼠（18-20g）建立了肺癌荷瘤小鼠模型。然后将其随机分为3组(PBS组, Exoctrl 组, ExoscFv 组, n = 3)以评估scFv修饰的外泌体的分布。为了评估抗肿瘤作用，将患有BM肿瘤的小鼠随机分为三组（n = 5）(PBS组, ExoscFv/siLPCAT1组, ExoscFv/siNC组)。
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LPCAT1在肺癌脑转移的恶性细胞中高度上调
为了进一步了解LPCAT1在NSCLC原发性肿瘤和转移性病变中表达的异质性和意义，我们获得并分析了肺腺癌脑转移单细胞转录组测序数据集（GSE131907）。在数据处理和注释后，对均匀流形近似和投影（UMAP）图谱和27种细胞亚型进行分层。30272个上皮癌症细胞以0.8的分辨率分类为3个簇，原发性癌症细胞、转移性脑肿瘤细胞和转移性淋巴结癌症细胞可以通过UMAP图最佳分离，表明脑转移和原发性肿瘤之间的恶性细胞存在显著的异质性（图1A-B）。此外，发现LPCAT1的表达显著升高，特别是在BM样品中，这表明LPCAT1上调的恶性癌症细胞易于迁移到大脑（图1C-D）。
图1 通过scRNA-seq分析鉴定LPCAT1表达模式。（A）基于GSE131907数据集的主要细胞谱系和组织学类型（包括原发性肺肿瘤、脑转移组织）着色的细胞亚群的UMAP图。（B）基于组织类型（包括肺、脑转移、淋巴结组织和胸水细胞）着色的所有样本的UMAP图。（C-D）由UMAP图和Violin图表示的LPCAT1在肺肿瘤、脑转移、淋巴结组织中的平均表达。
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ExoscFv的体内分布
为了评估ExoscFv的肿瘤靶向能力，我们首先建立了荷瘤小鼠模型，通过尾静脉注射200µg DiD标记的Exoctrl或ExoscFv（图2A）。使用IVIS在1小时、24小时、48小时和96小时监测外泌体的生物分布。如图2B所示，自注射后1小时起，可以产生足够的荧光，并逐渐扩散到全身，尤其是网状内皮系统，如肝、肺和脾。然而，对照组肿瘤块中的荧光强度在注射后48小时前开始减弱（图2C）。相反，ExoscFv组的肿瘤荧光强度在48小时达到峰值。
此外，ExoscFv组在96小时的残余荧光强度是Exoctrl组的两倍。值得注意的是，通过离体荧光成像验证，肿瘤中滞留了大量的外泌体（图2C）。此外，冷冻组织切片的荧光成像显示，DiD标记的外泌体主要在肺和肝中检测到，其次是肾、心脏和肿瘤，与体内成像结果一致（图2E）。此外，ExoscFv在肺、肾、肝和肿瘤中的半衰期分别为14.51小时、22.23小时、32.89小时和71.37小时。这些结果表明，EGFR-scFv修饰有效地增强了外泌体的肿瘤靶向性，并延长了外泌物在肿瘤中的滞留时间。
图2（A） 实验过程示意图。通过尾静脉将200µg ExoscFv、200µg Exoctrl或PBS注射到PC9荷瘤小鼠中，n = 3，外泌体剂量 = 10 mg/kg。（B）外泌体分布的全身图像。注射后在指定时间间隔获得的图像，n = 3。（C） 肿瘤部位荧光强度随时间的变化，n = 3.（D）注射后96小时DiD标记的外泌体在器官中分布的离体荧光成像。（E） 肿瘤冷冻切片的荧光图像通过共聚焦荧光成像（红：DiD，蓝：DAPI）
为了进一步评估ExoscFv的脑渗透性和骨髓损伤靶向能力，我们根据先前的方法开发了动物骨髓模型。将稳定表达荧光素酶的PC9细胞通过脑实质内植入注射到BALB/c裸鼠的纹状体中。通过生物发光成像监测肿瘤生长。一周后，体内成像显示BM模型成功建立，因为在植入部位观察到IVIS阳性灶。分别通过尾静脉给荷瘤小鼠注射DiD标记的Exoctrl或ExoscFv。使用IVIS在0.5小时、3小时、6小时和24小时监测外泌体的生物分布。
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本研究采用24小时IVIS成像。如图3A-B所示，注射后3小时的成像显示ExoscFv在小鼠大脑的肿瘤部位快速积聚，因为荧光强度远大于Exoctrl组。值得注意的是，有大量的外泌体定位在大脑中（图5C-D）。此外，如图5E-F所示，与注射Exoctrl的小鼠相比，来自注射ExoscFv的小鼠大脑的PC9 BM切片表现出显著增加的DiD信号强度，并且在相邻的正常脑组织中没有观察到信号。重要的是，两组的荧光差异在BM模型中出现得更早，这可能是由于血脑屏障的存在，因为外泌体必须以较慢的速度进入肿瘤部位。
图3 PC9 BM模型中ExoscFv和Exoctrl的体内分布。（A） 外泌体分布的全身图像。注射后在指定时间间隔获得的图像，n = 3，外泌体剂量 = 10 mg/kg。（B）大脑部分荧光强度随时间的变化，n = 3.（C）注射后24小时主要器官的离体荧光图像。（D） BM模型的离体荧光图像。（E） 通过共聚焦荧光成像（红：DiD，蓝：DAPI）拍摄肿瘤冷冻切片的荧光图像。比例尺= 750μm（左）、150μm（中）、75μm（右）trl。（F） 图5E中荧光信号强度的量化****
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ExoscFv/siLPCAT1具有体外抗肿瘤作用
为了验证LPCAT1是否可以成为NSCLC BM治疗的治疗靶点，在本研究中，首先制备了siLPCAT1负载的ExoscFv。随后，文章评估了负载LPCAT1 siRNA的外泌体（ExoscFv/siLPCAT1）在PC9细胞中的基因沉默效果。PC9细胞具有比Beas2b肺上皮细胞更高的EGFR表达。与对照相比，ExoscFv/siLPCAT1导致PC9中LPCAT1的表达显著降低（图4A-B）。接下来，通过CCK8和FCM检测，探讨了ExoscFv/siLPCAT1在癌症肺细胞增殖和凋亡中的作用。CCK8测定显示，与对照组相比，ExoscFv/siLPCAT1组的细胞增殖受到显著抑制（图4C）。类似地，FCM测定显示，在ExoscFv/siLPCAT1组中，PC9细胞的增殖活性显著降低（图4D-E）。FCM测定还显示，相较于ExoscFv/siNC处理的细胞（5.84 ± 0.88%），ExoscFv/siLPCAT1处理的PC9细胞具有显著更高的晚期凋亡率（13.03 ± 0.73%）（p
图4 ExoscFv/siLPCAT1的体外抗肿瘤作用。（A） 用ExoscFv/siLPCAT1或ExoscFv/siNC处理的PC9细胞中LPCAT1蛋白表达的蛋白质印迹分析。（B） 用ExoscFv/siLPCAT1或ExoscFv/siNC处理的PC9细胞中LPCAT1 mRNA表达的相对变化（数据表示为平均值 ± SD.n = 3.（C） 用PBS、ExoscFv、ExoscFv/siLPCAT1或ExoscFv/siNC处理的PC9细胞的CCK8测定，数据表示为平均值 ± SD.n = 3.（D-E）用PBS、ExoscFv、ExoscFv/siLPCAT1或ExoscFv/siNC处理的PC9细胞中ki67表达的流式细胞术测定
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ExoscFv/siLPCAT1具有体内抗肿瘤作用
接下来，文章探讨了EGFR特异性scFv功能化的ExoscFv是否可以在体内有效地将siLPCAT1通过血脑屏障递送到癌症的BM部位。体内测定程序的示意图如图5A所示。注射后第二天记录小鼠的体重，并在同一时期通过IVIS监测肿瘤生长。如图5B所示，与PBS或ExoscFv/siNC处理的小鼠相比，ExoscFv/siLPCAT1处理组中的小鼠在第一周的体重减轻更少，并且从第19天到第21天，体重显著减轻。文章证明，与对照组相比，ExoscFv/siLPCAT1具有优越的抗肿瘤效果，因为IVIS中测得的脑转移的平均负荷光子通量显著较低。用PBS或ExoscFv/siNC处理的小鼠中的肿瘤快速生长并发出强发光。ExoscFv/siLPCAT1处理组显示出明显更小的生物发光面积和较弱的强度，定量显示，第19天，ExoscFv/siLPCAT1的肿瘤发光强度比ExoscFv/siNC组低约4.51倍（图5C）。为了证明siLPCAT1在体内的沉默功效，我们通过免疫荧光染色分析进一步检测了LPCAT1的BM位点表达。与PBS和ExoscFv/siNC组相比，来自ExoscFv/siLPCAT1组的肿瘤中LPCAT1的表达显著下调（图5D）。同时，为了阐明LPCAT1下调影响下BM的细胞增殖和凋亡变化，进行了TUNEL和Ki67染色。如图7D和图S7A所示，与用PBS或ExoscFv/siNC处理的小鼠相比，用ExoscFv/siLPCAT1处理的小鼠的肿瘤中TUNEL阳性细胞的数量显著增加。相应地，在来自ExoscFv/siLPCAT1组的肿瘤中也检测到Ki67阳性细胞数量的显著减少（图5D）。
图5 ExoscFv/siLPCAT1在体内的抗肿瘤作用。（A） 实验过程的示意图。（B） 用ExoscFv/siLPCAT1、ExoscFv/siNC或PBS处理的BALB/C裸鼠的体重变化， n = 5。外泌体剂量 = 5mg/kg。（C）注射后在指定的时间间隔用ExoscFv/siLPCAT1、ExoscFv/siNC或PBS处理的裸鼠的BM组织的代表性生物发光图像，n = 每5。（D） 共聚焦荧光成像检测BMs切片中LPCAT1（绿色）、ki67（绿色）和tunel（绿色）的信号。比例尺= 50微米
本研究展示了一种制备EGFR特异性scFv靶向外泌体的方法，该方法可增强外泌体的抗癌活性。scFv通过基因工程与lamp2b C端融合，是将治疗和诊断试剂输送到肿瘤部位的理想工具。外泌体的EPR效应和单链抗体的主动靶向特性使外泌体获得了良好的靶向特性。scFv修饰显著延长了外泌体在皮下肿瘤中的保留时间。此外，我们的ExoscFv成功地将LPCAT1 siRNA通过血脑屏障转运到靶向BM位点，并显示出强大的抗肿瘤功效，毒性可忽略不计。因此，基于外泌体的EGFR靶向siRNA递送系统是癌症BM的一种有前途的治疗策略，这将有望开发新的肺癌治疗方法。
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